三类常用消毒剂对非洲猪瘟病毒灭活效果的评价

南文龙, 巩明霞, 邹艳丽, 刘珊,陆游,2, 吴晓东*，陈义平*

(1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032; 2.扬州大学, 江苏扬州 225009)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。自2018年8月农业农村部发布沈阳沈北新区发生首起非洲猪瘟疫情[1]至今，非洲猪瘟已蔓延至我国多个省市自治区，给养猪业及相关行业造成了巨大经济损失和深远影响。

ASFV对高温、腐败、干燥、冻融、超声波和极端pH 值等环境条件具有较强的抵抗能力，但本身作为囊膜病毒，对消毒剂的抵抗能力较差，常用的消毒剂均可有效将其灭活[2-4]。我国农业农村部发布的《感染非洲猪瘟养殖场恢复生产技术指南》、《非洲猪瘟疫情应急实施方案》(2020 年第二版)、《非洲猪瘟常态化防控技术指南(试行版)》等系列防控文件中，均对用于ASFV防控用消毒剂种类和使用方法进行了推荐。

当前我国生猪产业实践中在使用多种不同类型、组方及工作浓度的消毒剂产品，对ASFV的灭活效力凾需科学、客观评价。本研究选择市售常用的戊二醛类、酚类、含氯类消毒剂，参考OIE 参考实验室有关操作流程，评价其对ASFV的灭活效果，以期为生猪养殖、运输调运、屠宰加工、检验检疫等工作中消毒剂的选择和使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 消毒剂 收集市面常见的戊二醛类、酚类、含氯类消毒剂，其中戊二醛类6 种，商品代号A1～A6；酚类6 种，商品代号B1～B6；含氯类3种，商品代号C1～C3。消毒剂产品详细信息见表1，试验时消毒剂均在有效期内。

1.2 病毒 非洲猪瘟病毒African Swine Fever Virus isolate CN2018/1株，由国家非洲猪瘟参考实验室分离鉴定。

1.3 试剂与耗材 DMEM培养基、胎牛血清为GIBCO公司产品；细胞瓶及96孔细胞板购自Corning公司。

1.4 猪肺泡巨噬细胞、猪红细胞和血清的制备 无菌采集健康猪肺脏，向肺脏注入灭菌PBS灌洗数次，收集灌洗液，离心收集猪肺泡巨噬细胞，按5×106/mL浓度100 μL/孔接种96孔板。次日铺板，进行测试。同步无菌采集抗凝血，离心收集血清，之后将细胞沉淀洗涤3～5次，弃去白细胞和血小板，用PBS配成10%猪红细胞悬液，4 ℃ 保存备用。

1.5 消毒剂对细胞状态影响试验 依据畜禽栏舍、运载工具、器具消毒目的，按消毒剂说明书推荐合理选择高、中、低3个工作浓度，并将消毒剂原液制成10倍工作浓度备用。将0.1 mL 10倍工作浓度液加入到0.9 mL含1%猪血清的PBS中充分混合，混合物分别在20 ℃和4 ℃条件下作用30 min。阴性对照组，直接取1 mL含1%猪血清的PBS，按相同条件作用处理。

表1 消毒剂产品信息表

作用结束后，采用含1%猪血清的PBS连续10倍稀释上述各组作用后产物至10-8，每孔50 μL接种猪肺泡巨噬细胞培养物，同时加入1%猪红细胞10 μL，每个稀释度(含未稀释作用产物即原液)做4重复孔。将96孔板置于37 ℃ 5%CO2条件下培养6 d，观察记录细胞状态。评估消毒剂对猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞状态影响，用于消毒剂对ASFV灭活作用试验参照。

1.6 消毒剂对非洲猪瘟病毒灭活作用试验 参考OIE参考实验室开展的消毒剂对ASFV灭活效力评估操作流程，制定本试验方案。按1.5方法，稀释消毒剂至10倍工作浓度备用。测试组，将0.1 mL 10 倍工作浓度液和0.1 mL ASFV培养物加入到0.8 mL含1%猪血清的PBS中充分混合，混合物分别在20 ℃和4 ℃ 条件下作用30 min。阳性对照组，将0.1 mL ASFV 培养物加入到0.9 mL含1%猪血清的PBS中充分混合，按相同条件作用处理。阴性对照组，直接取1 mL含1%猪血清的PBS，按相同条件作用处理。

作用结束后，用含1%猪血清的PBS连续10倍稀释各组作用后产物至10-8，每孔50 μL接种猪肺泡巨噬细胞培养物，同时加入1%猪红细胞10 μL，每个稀释度(含未稀释作用产物即原液)做4重复孔。将96 孔板置于37 ℃ 5% CO2条件下培养6 d，每天观察、记录并统计各稀释度培养孔中红细胞吸附(Hemadsorption, HAD)反应结果；如结果可疑或无法判定，再次传代后综合判定结果。重复试验2次，统计消毒剂不同工作浓度下各培养孔中HAD结果，采用Reed-Muench法计算半数红细胞吸附量(HAD50)，测定病毒滴度Log10HAD50/mL。参照卫生部颁布的2002版《消毒技术规范》[5]计算平均灭活对数值，消毒后平均灭活对数值≥4，判为有效灭活ASFV。平均灭活对数值按如下方法计算：设阳性对照组平均病毒感染滴度(HAD50)为N0，试验(消毒)组平均病毒感染滴度(HAD50)为Nx，平均灭活对数值 = log10N0-log10Nx。

2 结果与分析

2.1 消毒剂对细胞状态影响试验结果 戊二醛类、酚类、含氯类消毒剂对细胞状态影响结果详见表2。其中，戊二醛类、酚类消毒剂对细胞状态影响可见于原液、10-1～10-3稀释孔中，主要表现为猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞死亡固定(当细胞孔中消毒剂有效成分含量较高时)与不同程度的破碎、崩解。含氯类消毒剂对细胞状态影响相对较小，仅消毒剂C1的1∶300、C2的1∶200、C3的 1∶200和1∶400工作浓度的原液孔中，与阴性对照组相比，猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞轮廓略显模糊、折光性下降，状态相对较差，但形态未见明显异常。

表2 消毒剂对细胞状态影响试验结果

2.2 消毒剂对非洲猪瘟病毒灭活作用试验结果 阳性对照组培养6 d后发生显著细胞病变，猪肺泡巨噬细胞大量萎缩、死亡脱落，部分猪肺泡巨噬细胞聚团且附着大量猪红细胞，经Reed-Muench法计算病毒液滴度为107.2HAD50/mL。阴性对照组中细胞形态无异常，猪肺泡巨噬细胞轮廓清晰，大多数呈圆形或椭圆形，均匀附着于96孔板底，猪红细胞均匀散落于猪肺泡巨噬细胞间隙中。

消毒剂对ASFV 灭活检测结果详见表3。6 种戊二醛类消毒剂和6种酚类消毒剂，在本试验中各工作浓度下原液及不同稀释度培养孔中均未发现HAD现象，与阳性对照相比，平均灭活对数为7.2，表明有效灭活ASFV。参照消毒剂说明书主要成分综合分析，戊二醛类消毒剂中，有效成分浓度≥0.1%的戊二醛(A1的1∶200工作浓度)，或≥0.05%戊二醛+ 0.03%苯扎氯铵(A3的1∶300工作浓度)，或≥0.0025%戊二醛+0.0025%癸甲溴铵(A5、A6的1∶2000工作浓度)，均可有效灭活ASFV。酚类消毒剂中，有效成分浓度≥0.1%的酚41%～ 49%、醋酸22%～26%和十二烷基苯磺酸(B5的1∶1000工作浓度)，或≥0.015%邻苯基苯酚+0.015%对氯间甲酚(B3的1∶800工作浓度)，均可有效灭活ASFV。3种含氯类消毒剂(成分二氯异氰脲酸钠)则需在说明标明浓度范围的较高工作浓度——C1的1∶300、C2的1∶200及C3的1∶200和1∶400才未发现HAD现象，综合分析有效成分浓度≥0.1%有效氯时，平均灭活对数为7.2，表明有效灭活ASFV。

3 讨论与结论

目前，在非洲猪瘟疫情应急处置和养殖场日常防控工作中，主要依靠扑杀和执行高水平的生物安全措施，使用化学消毒剂杀灭病毒阻断传播，仍是现阶段ASFV防控依赖的重要手段。

本研究中所用消毒剂对ASFV均有灭活作用，但灭活效果因消毒剂的种类和工作浓度不同有所差异。相同工作浓度的同一消毒剂产品，在4 ℃和20 ℃这两种条件下的灭活效果基本一致。戊二醛类和酚类消毒剂，在说明书推荐的工作浓度下，均可有效灭活ASFV；含氯类消毒剂需在其说明书标明浓度范围的较高工作浓度时，即有效氯浓度≥0.1%时，可有效灭活ASFV。

表3 消毒剂对非洲猪瘟病毒灭活试验结果

与含氯类消毒剂相比，戊二醛类和酚类消毒剂对细胞毒性作用更加明显，临场使用保证消毒效果的同时，应注意控制工作浓度并减少人员暴露。含氯类消毒剂毒性相对较小，但消毒效果易受到环境有机物影响。Shirai等[6]研究表明，有效氯浓度为0.03%～0.0075%的次氯酸钠，即在细胞水平上有效灭活ASFV，平均灭活对数为4.5。Krug等[7]研究显示，浓度为2000 ppm 次氯酸钠才可有效灭活木材表面上的ASFV，平均灭活对数为4.43，其所用工作浓度显著高于细胞水平验证浓度。本研究测试有效成分为二氯异氰脲酸钠的消毒剂，有效氯浓度为0.1%时，可有效灭活细胞培养物中的ASFV，临场使用时可根据消毒对象性质适当提高其工作浓度。

本研究从细胞水平上评价了戊二醛类、酚类、含氯类消毒剂对ASFV的灭活效力，结果表明在适当工作浓度下三类消毒剂均可有效灭活ASFV。临场消毒时，除选择适当的消毒剂种类和工作浓度外，在消毒前进行有效机械清洁，并确保适当作用温度和时间，方可获得较好消毒效果[8]。本研究将为生猪养殖、运输调运、屠宰加工、检验检疫等工作中的消毒剂选择和使用提供参考。