不同氨基酸对泰万菌素发酵影响的研究

刘 杨，张 萍，石彦鹏，牛 春

(宁夏泰瑞制药股份有限公司技术中心，银川 宁夏 750101)

泰万菌素又称乙酰异戊酰泰乐菌素，是由英国伊科动物保健品有限公司研发的新型大环内酯类抗生素。2004年9月9日经欧盟批准用于预防和治疗由猪肺炎支原体引起的猪气喘病、由猪痢疾短螺旋体引起的猪痢疾、由胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠炎和由鸡毒支原体引起的鸡支气管感染[1]；2012年7月6日经由FDA批准用于预防由胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠炎[2]。目前国内已批准酒石酸泰万菌素预混剂和可溶性粉用于预防和治疗猪、鸡支原体感染和猪血痢短螺旋体以及其他敏感细菌感染[3]。具有低毒、高效、低残留等优点，并不产生大环内酯类抗生素之间的交叉感染，是一类较好的治疗呼吸道和消化道感染的大环内酯类抗生素[3]。该产品目前尚属国际专利保护期，该专利属于日本美露香公司，2002年英国依科公司买断。现英国依科公司委托山东鲁抗委托加工。

抗生素发酵单位是标志生产水平的重要指标，研究表明，在泰万菌素发酵培养基中加入氨基酸对发酵转化率和发酵单位都具有显著影响[3-5]。为此，本研究对泰万菌素发酵培养基中的氨基酸种类进行了研究，获得对其发酵过程影响最大的氨基酸为亮氨酸，赖氨酸和甘氨酸。在此基础上用正交试验设计对氨基酸比例进行了优化，明显提高了泰万菌素的转化率。

1 材料与方法

1.1 菌种 耐热链霉菌16-926 菌种由本公司实验室保藏。

1.2 原材料 葡萄糖(天津市凯通化学试剂有限公司)；玉米浆(华北制药康欣有限公司)；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)；可溶性淀粉(国药集团化学试剂有限公司)；棉籽饼粉(大荔伟恒生物科技有限公司)；玉米蛋白粉(内蒙阜丰生物科技有限公)；聚醚消沫剂(宜新市江山生物科技有限公司)；亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、甘氨酸(天津市光复精细化工研究所)。

1.3 仪器设备 Waters 600高效液相色谱仪(美国Waters)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津)；TDL-5-A型台式离心机(上海安亭科技有限公司)；BSA2202S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；PHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)；SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；CX31型显微镜(日本奥林巴斯光学工业株式会社)。

1.4 菌种培养基[6]斜面培养基：胰胨豆汤培养基：胰胨豆汤粉30 g，蒸馏水1000 mL。

种子瓶培养基：可溶性淀粉20 g，大豆粉20 g，磷酸氢二钾0.5 g，七水硫酸镁 0.5 g，Yeast extract 1.0 g。

发酵瓶培养基：可溶性淀粉60 g，大豆粉20 g，酵母粉 4 g，七水硫酸镁 5 g，棉籽粉7 g，Yeast extract 1.0 g。

1.5 方法

1.5.1 氨基酸的选择

1.5.1.1 单因素

表1 发酵培养基中几种氨基酸的单因素水平表

1.5.1.2 多因素

表2 发酵培养基中几种氨基酸的组合水平表

1.5.1.3 氨基酸比例

表3 发酵培养基中几种氨基酸的不同比例水平表

1.5.2 发酵瓶的培养 用无菌的不锈钢铲在无菌条件下铲取1.5～2 cm2左右的菌丝体接种于种子瓶，置温度29 ℃，湿度30～50%，转速为220 r/min的摇瓶机上振荡培养 48 h，补入底物继续转速为220 r/min的摇瓶机上振荡培养144 h发酵培养。

1.5.3 发酵瓶T2i5含量测定方法 称取发酵液1 mL溶于无水甲醇溶液5 mL，超声振荡器振荡2～3 min，充分混匀后用0.22 μm有机滤膜过滤后备用。高效液相色谱条件 Agilent Extend-C 18色谱柱，柱温：40 ℃。流动相：A相为0.1%甲醇水溶液，B相为乙腈；流速为0.4 mL/min。进样体积为5 μL[7]。

1.5.4 核酸检测方法 称取发酵液2 mL于10 mL离心管中高速离心机离心，弃去上清液，加入10%三氯乙酸溶液旋涡振荡1～2 min，高速离心机离心，弃去上清液，加入5%三氯乙酸溶液旋涡振荡1～2 min，沸水浴30 min，冷却后高速离心机离心，取上清液加入纯化水中充分混摇，紫外分光光度计290 nm处比色。

2 结果与分析

2.1 不同氨基酸(单因素)对发酵过程的影响

由图1可知，发酵培养基中补入亮氨酸或甘氨酸PH值在工艺范围之内，赖氨酸与色氨酸的PH值或高于工艺范围、或低于工艺范围。

图1 不同氨基酸(单因素)对发酵培养基中PH值的影响

图2 不同氨基酸(单因素)对发酵培养基中核酸的影响

由图2可知，发酵培养基中补入亮氨酸或甘氨酸核酸含量明显大于赖氨酸与色氨酸。

图3 不同氨基酸(单因素)对发酵过程中T2i5含量的影响

由图3可知，发酵培养基中补入亮氨酸或甘氨酸T2i5含量明显大于赖氨酸与色氨酸。

2.2 不同氨基酸(多因素)对发酵过程的影响

表4 不同氨基酸(多因素)对发酵过程中的影响

由表4可知，发酵培养基中补入亮氨酸、色氨酸和甘氨酸在PH值、核酸含量和T2i5含量方面明显优于其他组合，对其比例再次进行正交实验。

2.3 氨基酸正交试验设计 对氨基酸作了四因素三水平(L934)的正交实验设计其它不变，其试验设计和结果如表5～表6。

表5 摇瓶发酵正交结果

表6 正交实验结果方差分析

从表5、表6可以看出，4号实验摇瓶效价最高，平均达到16980 μ/mL，再通过直观分析和方差分析发现，亮氨酸对摇瓶效价的影响比较大，为主要影响因子。根据结果选4号配方和A0.2B0.2C0D0.1配方作进一步验证，同时用原配方作为对照，验证结果如表7。

表7 与原配方对比结果

3 结果与讨论

大环内酯类抗生素内酯环的形成需要乙酸、丙酸和丁酸作为前体物质，而这些物质来源于三羧酸循环和氨基酸代谢等途径。主要考察了亮氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸作为泰万菌素生物合成前体物质对发酵培养基的影响。根据实验数据表明亮氨酸、赖氨酸、甘氨酸对泰万菌素发酵的转化率和发酵单位具有显著影响。研究发现，单一加入亮氨酸的发酵培养基PH值一直维持在工艺范围之内，核酸含量和T2i5含量均为最高；单一加入赖氨酸的发酵培养基PH值最低超过工艺范围，核酸含量和T2i5含量均为最低；单一加入色氨酸的发酵培养基PH值最高超过工艺范围，进而影响核酸含量和T2i5含量只高于赖氨酸；单一加入甘氨酸的发酵培养基PH值在工艺范围之内，核酸含量和T2i5含量均稍低于亮氨酸，而高于色氨酸和赖氨酸。因此说明氨基酸单因素因子中亮氨酸、色氨酸、甘氨酸起显著作用。

由于考虑到不同氨基酸种类之间对发酵培养基的影响，再次对发酵培养基中氨基酸种类进行组合实验发现发酵培养基中同时加入亮氨酸、色氨酸、甘氨酸三种氨基酸的PH值、核酸含量和T2i5含量最优，同时对亮氨酸、色氨酸、甘氨酸三种氨基酸进行了正交实验优化出其最优比例为亮氨酸0.2%、色氨酸0.1%、甘氨酸0.2%。因此确定亮氨酸、色氨酸、甘氨酸为泰万菌素发酵影响显著因子。在原培养基配方中按照亮氨酸0.2%、色氨酸0.1%、甘氨酸0.2%比例加入三种氨基酸，使得摇瓶效价从14000 μ/mL提高到18000 μ/mL，效价提高了28.5%

结果表明亮氨酸、色氨酸、甘氨酸加入到发酵培养基对泰万菌素发酵转化率影响显著。目前世界范围内氨基酸种类具有36种，实验只对实验室常见的几种氨基酸进行了试验，不同氨基酸对泰万菌素发酵影响还可以进一步扩大研究范围。