兽药典收载羊败血性链球菌病疫苗生产检验用菌种的系统分类鉴定

李伟杰，田 野，岂晓鑫，魏财文，李 建，张一帜，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

细菌分类学始于19世纪后半叶，起初采用表型分类方法进行简单分类，但在揭示细菌间的系统发育关系方面具有局限性[1]。20世纪60年代，DNA-DNA杂交(DNA-DNA hybridization，DDH)被称为分类学中的“金标准”，70%的DNA-DNA的杂交值已被作为种间阈值在原核生物的分类中得到广泛应用[2-3]，现在可以用细菌的全基因组序列进行数字DNA-DNA杂交值的计算[4]。20世纪80年代后，因序列保守且不受水平基因转移的影响，16S rRNA基因序列分析方法被广泛用来细菌分类鉴定，种间阈值经历了97%、98.7%～99.0%、98.2%～99.0%、98.65%的变化[5-8]。随着高通量测序技术的发展，比表型特征和基因片段序列分析更精确的基于全基因组序列分析的方法被用于细菌分类，主要的分析方法包括平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity, ANI)[9]、基因组局部相似性搜索距离系统发育分析(Genome blast distance phylogeny, GBDP)[10]、最大唯一匹配指数分析(Maximal unique matches index, MUMi)[11]。其中ANI被广泛使用和认可，95%～96%的ANI值等同于70%的DDH值，相对应于98.65%的16S rRNA基因同源性，使其成为下一代细菌鉴定金标准的候选[8]。本文对《中华人民共和国兽药典》三部2015年版收载的羊败血性链球菌病疫苗生产检验用菌种CVCC 553、55001和55002[12]，按现有细菌分类鉴定方法进行了系统分类鉴定，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌种 CVCC 553、55001和55002由中国兽医药品监察所国家兽医微生物中心提供，为羊败血性链球菌病疫苗生产检验用菌种。

1.2 培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，BUG培养基购自Biolog公司，缓冲肉汤培养基、马丁肉汤培养基购自北京中海生物科技有限公司。

1.3 试剂 马血清购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，无菌脱纤维绵羊血自采，革兰染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，PCR相关试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，链球菌乳胶分群试剂盒购自丹麦国家血清研究院，C1接种液和Gen III鉴定板购自Biolog公司。

1.4 菌种的培养 无菌开启菌种CVCC 553、55001和55002冻干安瓿瓶，用TSB肉汤充分溶解，接种含5%马血清的TSA平板，37 ℃，5%CO2，培养24 h后转接含5%马血清的TSA平板，连续纯化2代后接种含5%马血清的TSA平板和含10%无菌脱纤维绵羊血琼脂平板，37 ℃，5% CO2，培养18 h～24 h后观察。

1.5 菌种的革兰染色 革兰染色参照说明书操作。

1.6 菌种血清群的鉴定 用链球菌乳胶分群试剂盒中亚硝酸提取试剂，参照说明书操作步骤，提取链球菌群特异性多糖抗原，与分群血清进行反应，30 s内判定结果。

1.7 菌种Biolog鉴定 取菌种CVCC 553、55001和55002的纯培养物划线接种含5%脱纤维绵羊血的BUG培养基，37 ℃，5% CO2，培养24 h。将一次性棉签用C1接种液稍微浸湿，然后蘸取单菌落在试管内壁接种液液面上方干燥部位，旋转挤压棉签，尽量使菌落分散，然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合，形成均一、无团块的菌悬液，调整浊度范围在96%～98%。静置片刻后将菌悬液接种到Gen III鉴定板中，100 μL/孔，放置在湿盒中，37 ℃，5% CO2培养，通过Biolog微生物鉴定系统MicroStation中的软件读取Gen III鉴定板上菌种的表型图谱。

1.8 菌种16S rRNA序列测定和分析 菌种CVCC 553、55001和55002的DNA提取和16S rRNA的扩增参照文献[13]， PCR产物由中美泰和生物技术(北京)有限公司完成序列测定。用Bioedit软件对16S rRNA测序结果进行质控和序列拼接，拼接后的序列提交到https:∥www.ezbiocloud.net/进行比对，选取相似性高的菌株序列，利用MEGA-X软件中的Clustal W方法进行同源性比对，采用邻接法(Neighbor Joining，NJ)获得分支系统发育树，系统发育树各分支的置信度经重抽样法1000次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋予相同的加权值。

1.9 菌种的全基因组序列测定和分析 菌种CVCC 553、55001和55002全基因组的提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA经检测合格后送上海美吉生物医药科技有限公司测定，在https:∥www.dsmz.de/在线计算DNA-DNA的杂交值[4]，在https:∥www.ezbiocloud.net/在线计算平均核苷酸同源性[14]。

2 结果与分析

2.1 菌种染色特性及菌体形态 菌种CVCC 553、55001和55002均为革兰阳性球菌，呈单个、成对和短链排列。

2.2 菌种菌落形态及培养特性 菌种CVCC 553、55001和55002在含10%无菌脱纤维绵羊血平板上培养18 h形成灰色、半透明、湿润、黏稠菌落，在含10%无菌脱纤维绵羊血平板上培养24 h后呈β溶血。

2.3 菌种血清分群结果 用链球菌兰氏分群试剂盒提取菌种CVCC 553、55001和55002的抗原，在反应卡上与含乳胶颗粒的分群血清进行反应，30 s内菌种CVCC 553、55001和55002只与链球菌兰氏C群血清发生凝集反应，形成蓝色的颗粒状凝集物(图1)，而与A、B、D、F、G群血清不发生凝集反应，判定菌种CVCC 553、55001和55002为兰氏C群。

A：CVCC 553，B：CVCC 55001，C：CVCC 55002

2.4 菌种Biolog鉴定结果 根据对71种碳源利用情况以及对23种化学物质敏感性的结果，菌种CVCC 553、55001和 55002经Biolog鉴定均为马链球菌反刍亚种。

2.5 菌种的16S rRNA序列分析结果 将菌种CVCC 553、55001和55002的16S rRNA序列拼接后提交到https:∥www.ezbiocloud.net/进行比对，用MEGA-X软件构建系统发育树，结果菌株CVCC 553、55001和55002与马链球菌反刍亚种模式菌株CECT 5772的同源性最高，均为99.72%，与马链球菌马亚种模式菌株ATCC 33398和兽疫亚种模式菌株NCTC 4676的同源性分别均为97.68%、97.73%和97.71%，在系统发育树中菌株CVCC 553、55001和55002与马链球菌反刍亚种模式菌株CECT 5772位于同一分支(图2)。

2.6 菌种的全基因组序列分析结果 菌种CVCC 553、55001和55002扫描图序列大小分别为2124577 bp、2186173 bp、2178262 bp，G+C mol%分别为41.0、41.1、41.0。将菌种CVCC 553、55001和55002扫描图序列提交到https:∥www.dsmz.de/进行全基因组序列分析[6]，结果显示菌种CVCC 553、55001和55002均与马链球菌反刍亚种模式菌株CCUG 47520的DNA-DNA的杂交值最高，分别为80.5%、80.2%、80.5%(表1)。将菌种CVCC 553、55001和55002扫描图序列提交到https:∥www.ezbiocloud.net/计算平均核苷酸同源性[7]，菌种CVCC 553、55001和55002与马链球菌反刍亚种模式菌株CECT 5772、兽疫亚种模式菌株NCTC 4676和马亚种模式菌株ATCC 33398的ANI值分别为97.73%、95.42%、96.22%，97.64%、95.51%、96.11%，97.77%、95.47%、96.04%。

3 讨论与结论

马链球菌目前分为3个亚种，分别为马亚种、兽疫亚种和反刍亚种[15-16]。其中马亚种只引起马、骡、驴的马腺疫[16-17]；兽疫亚种可致多种动物疫病，包括马的败血症和子宫炎、牛的乳腺炎和子宫炎、猪的败血症和关节炎、羔羊和幼犬败血症和肺炎等[17]；反刍亚种可引起绵羊和山羊的乳腺炎，2004年由Fernández等依据表型和基因型首先报道了该亚种[15]。我国兽药典中收载的羊败血性链球菌病疫苗是1973年青海兽医生物药品厂研制，生产检验用菌种为马链球菌CVCC 553、55001和55002。通过查阅现存档案，菌种CVCC 553、55001和55002最早的鉴定报告中采用形态和生化特性、培养特性及血清学特性来确定其分类地位，其中生化反应采用的是糖发酵管，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、山梨醇阳性，纤维二糖、甘露醇、棉子糖、鼠李糖、松三糖、水杨素、菊糖、树胶醛糖、木糖、七叶苷阴性。根据细菌鉴定的要求，仅依据以上鉴定项目不能在种水平上得出菌种CVCC 553、55001和55002是马链球兽疫亚种的结论。

表1 菌种CVCC 553、55001和55002 DNA-DNA杂交值

基于以上菌种鉴定过程中存在的问题，本文采用染色特性及菌体形态、菌落形态及培养特性、血清分群、Biolog鉴定、16S rRNA序列分析和全基因组序列分析对羊败血性链球菌病疫苗生产检验用菌种CVCC 553、55001和55002进行了系统分类鉴定，结果表明菌种的形态和培养特性与《中华人民共和国兽用生物制品规程》二○○○年版中的规定一致，但Biolog给出的结果均为马链球菌反刍亚种，16S rRNA序列与马链球菌反刍亚种模式菌株CECT 5772同源性最高且处于系统发育树的同一分支，基于全基因组序列的DNA-DNA的杂交值与马链球菌反刍亚种模式菌株CCUG 47520最高，分别为80.5%、80.2%、80.5%，均大于70%。以上结果都表明羊败血性链球菌病疫苗生产检验用菌种CVCC 553、55001和55002为马链球菌反刍亚种，而不是原命名的马链球菌兽疫亚种。在以上鉴定的基础上，对中国兽医药品监察所国家兽医微生物中心保藏的分离自青海、甘肃患败血症绵羊心血的4株马链球菌CVCC 549、550、551、552进行了系统分类鉴定，结果表明均为马链球菌反刍亚种。

本研究从表型水平和基因型水平对羊败血性链球菌病疫苗生产检验用菌种CVCC 553、55001和55002进行了系统分类鉴定，结果为《中华人民共和国兽药典》的修订提供了技术支持，同时也明确了马链球菌反刍亚种可引起羊败血性链球菌病。