慢加急性肝衰竭不同预后患者血浆外泌体差异蛋白的生物信息学分析

焦 彦， 张 莹， 时红林， 卢 旺， 陈德喜， 陈 煜， 时红波

1 首都医科大学附属北京佑安医院，北京市肝病研究所， 北京 100069；2 北京市肝炎与肝癌精准医疗及转化工程技术研究中心， 北京 100069；3 首都医科大学附属北京佑安医院 肝病中心四科， 肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室， 北京 100069

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿，其病死率为40%～60%[1]。ACLF与失代偿性肝硬化的主要区别之一是肝再生潜能。一些ACLF患者虽然病情严重，但仍可通过肝再生存活[2]。因此，对ACLF患者开展肝再生评估，对于临床治疗选择、预后判断尤为重要。外泌体是一种直径为30～100 nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质[3]。外泌体在多种肝脏疾病中发挥重要作用[4]。最新研究[5-7]表明，外泌体参与肝巨噬细胞活化和炎症反应以及肝细胞凋亡与增殖。ACLF时由于肝细胞大量坏死，肝脏来源的外泌体大量释放至外周血中，因此血液中外泌体可以实时反映肝细胞的功能状态，外泌体及其携带的蛋白质有望成为ACLF临床监测的重要工具。本研究通过非标记(Label-free)定量蛋白质组学技术对ACLF不同预后患者血浆外泌体蛋白进行鉴定和定量分析，筛选差异蛋白，通过生物信息学分析差异蛋白功能及生物学过程，为寻找ACLF预后判断的血清学标志物及进一步探讨发病机制提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 前瞻性选取2019年7月—10月首都医科大学附属北京佑安医院的住院确诊的ACLF患者10例。纳入标准：年龄16～65岁，性别不限，参考《肝衰竭诊治指南(2018年版)》[8]明确诊断为ACLF。排除标准：合并糖尿病、甲状腺功能亢进；合并严重心、脑、肾脏疾病及其他系统性疾病；合并恶性肿瘤或活动性消化道出血；慢性肝衰竭；依从性差者。前瞻性入组病例，随访90 d，死亡或肝移植者纳入肝移植/死亡组，存活者纳入生存组。

1.2 主要仪器和试剂 尿素(Bio-Rad)，硫脲(Sigma-Aldrich)，蛋白定量染液(Thermo Scientific)，胰蛋白酶(AB Sciex)，超声波细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司)，酶标仪(Thermo，Multiskan MK3)，电泳系统(bio-rad)，高效液相色谱仪(Thermo Scientic，EASY-nLC 1000 System)，质谱系统(Thermo，Q-Exactive)，超速离心机(Beckman，OptimaTMXPN-100)。

1.3 外泌体的分离 取外周血，经3000 r/min离心10 min获得血浆。血浆依次经2000 rcf离心10 min去除死细胞，10 000 rcf、4 ℃离心30 min去除细胞碎片。将上清液转移至超速离心管，110 000 rcf、4 ℃离心70 min获得外泌体。将获得的外泌体悬浮于PBS溶液中，-80 ℃保存以备进一步检测。

1.4 蛋白的提取和酶解 采集患者静脉血5 ml，离心，分离血清，采用超速离心法提取血浆外泌体。取样品加入适量尿素颗粒混匀，50∶1加入蛋白酶抑制剂，超声1 s，停1 s，累计10 s。140 00g离心30 min，提取上清液中的蛋白。BCA法测定患者蛋白水平。每例样本取10 μg进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色30 min，脱色直至背景清晰；将每块胶切成1 mm3小块儿，置于1.5 ml Eppendorf管中；用 200 μl双蒸水洗2次，每次10 min；加考染脱色液50 mmol/L NH4HCO3与ACN(1∶1)，脱色15 min，双蒸水洗，重复，直至脱色完全；加 ACN 100 μl脱水至胶粒变白，真空抽干10 min；加 10 mmol/L DTT(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，加 ACN 100 μl脱水至胶粒变白；加 55 mmol/L IAA(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，加 ACN 100 μl脱水至胶粒变白；依次用下列溶液进行混悬清洗：双蒸水、ACN、每次10 min；将 0.01 μg/μl胰蛋白酶工作液，每管加100 μl，让酶液与胶粒充分接触。待酶液被胶粒完全吸收，再加25 mmol/L NH4HCO3100 μl，37 ℃过夜；离心收集酶解上清液，置于另一个Eppendorf管中。真空冻干，-20 ℃保存。

1.5 质谱数据采集 本报告采用Orbitrap 质谱采集液相-串联质谱(LC-MSMS)数据。配制流动相 A 液(100%水、0.1%甲酸)和 B 液(100%乙腈、0.1%甲酸)。使用A相溶解粉末，4 ℃ 14 000g离心 20 min，取上清1 μg样品进样，液质检测。液相色谱洗脱条件如表1所示。使用Q Exactive质谱仪，Nanospray FlexTM(ESI)离子源，设定离子喷雾电压为 2.1 kV，离子传输管温度为250 ℃，质谱采用数据依赖型采集模式，质谱全扫描范围为 m/z 300～1400，一级质谱分辨率设为70 000，C-trap 最大容量为3×106，C-trap 最大注入时间为 60 ms；选取全扫描中离子强度 TOP 20 的母离子使用高能碰撞裂解方法碎裂，进行二级质谱检测，二级质谱分辨率设为17 500，C-trap最大容量为5×104，C-trap 最大注入时间为 80 ms，肽段碎裂碰撞能量设为 27%，生成质谱检测原始数据(.raw)。

表1 液相色谱洗脱条件

1.6 蛋白的鉴定和定量分析 Label-free的质谱分析是由Q-Exactive型质谱系统完成，产生的质谱原始文件采用产MaxQuant软件处理,并对蛋白质进行鉴定和定量分析。以倍数调>1.2倍或下调>1.2倍且P<0.05为标准筛选差异蛋白质。

1.7 生物信息学分析 通过Uniprot的注释信息对差异蛋白进行基因功能(GO)注释，通过Fisher精确检验，对差异蛋白进行功能(GO)富集分析，利用R-3.5.1软件对差异蛋白进行层次聚类分析。

1.8 伦理学审查 本研究方案经由首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会批准，批号：(2019)科研快审第(989)号。患者家属知情并签署同意书。

1.9 统计学方法 采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。计量资料以M(P25～P75)表示，两组间比较采用 Mann-WhitneyU秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 随访后纳入生存组患者5例，肝移植/死亡组患者5例。两组患者在性别、年龄方面差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表2 两组患者一般资料比较

2.2 蛋白鉴定和定量分析结果 共鉴定出4675个肽段，860种蛋白。通过定量分析，按照筛选标准共筛选出 116种差异表达蛋白，其中上调蛋白62种、下调蛋白54种。上调和下调最显著的15种蛋白见表3、4 。

表3 (肝移植/死亡组)/生存组上调差异蛋白

表4 (肝移植/死亡组)/生存组下调差异蛋白

2.3 生物信息学分析结果

为了更好地解释和剖析两组ACLF患者血浆外泌体差异蛋白谱，对血浆差异外泌体蛋白进行注释，同时完成生物信息学分析。

2.3.1 差异蛋白 GO 功能的富集分析结果 筛选出的 116 种差异蛋白主要参与免疫反应、信号转导、囊泡介导的转运、细胞运动、细胞死亡、细胞增殖等重要的生物学过程，同时还与细胞质、胞膜外区、细胞膜、质膜、细胞核、细胞骨架、细胞液泡、核内体等细胞组分密切相关，并具有金属离子结合、受体结合、信号传感器活动等分子功能(图1)。

注：CC，细胞组分；MF，分子功能；BP，生物学过程；条形图右侧为P值。图1 差异蛋白 GO 功能的富集分析结果

2.3.2 差异蛋白互作分析 将组间血浆外泌体差异蛋白进一步用数据库进行互作网络分析，蛋白互作关系见图2。结果表明，鉴定到的血浆外泌体差异蛋白中有38个差异蛋白被互作网络覆盖，表明具有较好的生物学联系，少数游离于互作网络之外蛋白可能由于功能相对独立或者与其他蛋白互作的可信度不高导致。KEGG 通路分析表明，差异蛋白在氨基酸的生物合成这一通路中不仅显著性最强，且富集的蛋白数目最多(图3)。

注：红色圈内表示上调表达蛋白，绿圈内表示下调表达蛋白。图2 蛋白质互作分析结果

3 讨论

非标记定量蛋白质组学近年来成为重要的质谱定量方法，MaxQuant是目前领先的蛋白质组学定性定量算法。本研究采用的最新一代的 Orbitrap 质谱采集 LC-MSMS 数据，采用非标记定量结合LC/MS质谱技术找到差异表达的外泌体蛋白质。与其他定量蛋白质组学技术相比，Label-free方法的应用范围广，可用于微量样品分析，速度快，重复性好，但在进行相对定量时，低丰度蛋白不易检测[9]。本研究共筛选出116 种外泌体差异蛋白，62种蛋白表现为上调、54种蛋白表现为下调。

在外泌体广泛的生理作用中，以细胞间的信息交流以及物质传递最为重要，外泌体含有丰富的蛋白质分子：一类为非特异性的蛋白质，出现在所有外泌体中，例如细胞骨架蛋白、四跨膜蛋白(CD9、CD63)和热休克蛋白家族等；另一类为非特异性蛋白，与外泌体的细胞来源相关，蛋白的含量可能会根据疾病状态而波动，例如B 淋巴细胞分泌的外泌体表面有 MHC-Ⅱ类分子；肿瘤细胞来源的外泌体携带大量肿瘤抗原，这类蛋白质可能与细胞信号转导功能相关[10-11]。

Ig是机体体液免疫应答时B淋巴细胞产生的免疫效应分子，在机体抵抗外来病原体中发挥着重要的作用。Ig由重链(H链，分为γ、α、μ、δ、ε链)和轻链(L链，分为κ型和λ型)组成。ACLF发生发展的标志是过度炎症反应，表现为患者血清中促炎细胞因子水平明显升高和免疫细胞活化标志物表达上调[12]。有研究[13]发现，HBV-ACLF患者存在Ig升高、补体下降及T淋巴细胞损耗。Ig、补体和T淋巴细胞计数等免疫指标的变化可反映体液免疫的应答情况，对于判断病情、评估预后及指导免疫治疗具有重要意义[14]。本研究表明，外泌体中携带的Ig可能参与了ACLF的体液免疫，由于不同预后患者处在疾病和免疫反应的不同阶段，故表现为上调或下调。在诊断ACLF时，可考虑作为血清学标志物。

在肝移植/死亡组上调的蛋白中，Drp1是蛋白质发动蛋白超家族的成员，由GTP酶和GTP酶效应结构域组成，Drp1可作用于线粒体外膜诱导线粒体分裂，对线粒体的分裂有重大意义[15]。抑制Drp1对几种肝损伤模型具有保护作用，包括由毒性试剂(千里光碱和镉)诱导的肝毒性损伤[16-17]、酒精诱导的肝毒性损伤[18]、营养性脂肪变性[19]和胆汁淤积性肝损伤的动物模型[20]。Diaph1是formin蛋白家族的一员，参与多种以肌动蛋白为基础的生物学过程，如伪足与细胞极性的形成、细胞黏附和运动等。研究[21-23]发现，Diaph1的基因突变与耳聋和巨血小板减少症相关，并且癌细胞中Diaph1的表达水平与疾病的临床分期和转移密切相关。Diaph1可使肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，促使HSC分泌肿瘤促进因子[24]。NCoR1被证明在再生或致癌过程中发挥独特的作用，其参与脂质代谢，调节肝脏脂肪酸从头合成[25]。ASL的缺乏则会导致慢性肝病和肝糖原代谢受损[26]。ACLF的病程中肝细胞的损伤和炎症贯穿疾病的始终，ACLF患者血浆外泌体中的Drp1、Diaph1、NCoR1、ASL是否可以作为ACLF早期诊断的血清学标志物，尚需要做进一步的验证。

膜联蛋白A6是膜联蛋白家族的一员，是一种钙依赖性磷脂酶结合蛋白，主要存在于啮齿动物肝细胞的质膜。研究[27]发现，膜联蛋白A6存在于癌症相关成纤维细胞来源的细胞外囊泡中，通过稳定激活FAK-YAP通路诱导胃癌耐药。膜联蛋白A6还可在肝切除的肝再生模型中通过影响葡萄糖稳态，进而影响肝切除后小鼠的存活率。研究[28]发现，膜联蛋白A6基因敲除小鼠在部分肝切除后表现出较低的存活率，缺乏膜联蛋白A6会损害小鼠丙氨酸依赖性糖异生和肝再生。这一发现与本研究中ACLF死亡组患者血浆外泌体中膜联蛋白A6表达下调的趋势一致。但是，对于装载在外泌体中的膜连蛋白A6，其是否参与ACLF患者的肝再生及氨基酸合成代谢等生物过程，能否作为ACLF肝再生及预后判断的血清学标志物，仍需进一步研究。

铁蛋白在人体各组织中广泛存在，目前被认为是一种肿瘤相关蛋白，其由 2 种不同的亚基构成，分别为H链和L链，即铁蛋白轻链(FTL)[29]，在血管形成、细胞增殖及免疫抑制中有重要作用[30]。铁的过度沉积产生自由基，破坏肝细胞的细胞器造成肝细胞受损，并可协同病毒等外因作用引起肝功能异常、肝炎、肝硬化乃至肝癌[31]。FTL与慢性肝脏疾病密切相关, 其表达水平不仅能体现肝损伤状况，还能反映肝脏疾病的进展情况[32]。研究[33]发现，铁蛋白在慢性肝病患者血清中的含量显著高于健康人群，这主要与肝脏炎性反应使铁蛋白合成增加，同时肝细胞坏死导致铁蛋白释放入血有关。但是，肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中铁蛋白轻链的含量均高于健康人群，但不同肝病组之间的表达可见随病情加重逐渐降低的趋势。ACLF患者病程中确实可见铁蛋白的代谢异常，本研究首次在ACLF患者血浆外泌体中检测到铁蛋白轻链，其可能参与了ACLF 发病过程，其水平可能反映了疾病的进展，后续有待实验对 FTL在慢性肝病中的表达进行分析，更好地验证本研究结果。

综上所述，本研究通过对ACLF患者血浆外泌体的蛋白质组学进行分析，筛选出116种外泌体差异蛋白，通过生物学信息分析，发现这些差异蛋白与肝脏免疫及炎症反应、糖类和氨基酸代谢、肝细胞损伤及再生等信号通路密切相关，从而为寻找ACLF预后判断的血清学标志物及进一步探讨发病机制提供了参考依据。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：焦彦负责实施研究过程和采集整理数据；张莹、卢旺负责调研整理文献；时红林负责技术或材料支持；陈德喜负责修订论文；陈煜负责患者入组及标本的收集整理；时红波负责提出研究选题，设计研究方案以及修订论文。