金花茶花瓣转录组分析及花瓣发育调控基因挖掘

李 博 刘合霞 刘 秦 周兴文

（广西农产资源化学与生物技术重点实验室，玉林师范学院，玉林 537000）

金花茶（Camellia nitidissima）是山茶科（Thea⁃ceae）山茶属（Camellia）植物，主要分布于我国广西南部地区及越南北部地区，是山茶属中唯一具有金黄色花瓣的珍稀植物类群，素有“茶族皇后”“植物界的大熊猫”的美誉［1］。金花茶花瓣金黄色，具有较高的观赏价值，同时也是一种药食两用植物，含有茶多酚、茶多糖、黄酮类等生理活性成分，此外还含有对人体健康有益的多种微量元素，如锗、锰、有机硒等元素［2］，具有清热解毒、利尿消肿等功效，可用于治疗高血压、咽喉炎、便血、痢疾、月经不调等疾病，另外，现代药理学的研究也表明金花茶具有杀菌、抗癌、防治“三高”等作用［3～5］。金花茶的花朵是主要的开发利用资源，而它的观赏性和药用价值很大程度上取决于花瓣的颜色及大小。因此，对金花茶花瓣发育进行研究具有重要的现实意义。

花瓣在大小、形状和颜色上变化很大，这种变异对异交物种中吸引传粉昆虫具有重要的适应性意义［6～7］。花瓣一直是园艺家们选择改良的目标，通过对花瓣性状的改良可以提高植物的观赏价值［8］。目前，花瓣已经成为植物器官发生研究的一个独特模型系统，因为花瓣对于植物的生长是可有可无的，花瓣存在与否对植物自身的生存能力影响相对较小［9］；此外，花瓣的形状和大小在很大程度上不受环境波动的影响［10］，上述特点使得它成为了分析器官发育的理想遗传控制系统。

在金花茶花瓣的发育过程中，其花瓣表型会发生明显的变化。这一过程始于绿色小花瓣的形成，它经历了一个主要由细胞分裂驱动的早期生长阶段，并伴随着色素开始合成；此时，花瓣细胞生长缓慢，但色素含量迅速增加，直至产生色素沉着，形成黄色的花瓣；随后，通过花瓣细胞的扩张，使花瓣达到最终的大小。虽然许多研究探讨了模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）花瓣的生长发育 调 控 机 制［11］，玫 瑰（Rosa chinensis）［12］、菊 花（Chrysanthemum morifolium）［13］等园艺植物花瓣伸长的调控机制，以及金花茶花瓣的色素苷生物合成的相关基因及调控机制［14］，但是控制金花茶花瓣发育及伸长的调控机制却知之甚少。随着测序技术的发展，RNA-seq 测序可用于分析整个转录组，通过检测unigene 表达的变化，可得到大规模的基因表达数据集。因此，本研究对不同发育时期的金花茶花瓣进行了转录组分析，以期揭示激素信号转导与转录因子家族在花瓣生长调控中的关系，建立与金花茶花瓣生长相关的基因网络信息，为深入研究金花茶花瓣在转录水平上的发育调控机制奠定理论基础，为金花茶分子育种实践及资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 金花茶花瓣转录组数据的获取及分析

此次研究所使用的数据来源于本课题组前期测序所获得的金花茶花瓣转录组测序数据。在前期的研究中，根据花瓣的表型特征，将金花茶的开花过程划分为幼蕾期（S1）、初蕾期（S2）、显色期（S3）、半开期（S4）、盛开期（S5）等5 个时期（见图1），采集每个时期的花瓣进行3 次转录组重复测序，共获得15个转录组测序样本，该数据已上传至NCBI（national center for biotechnology information）数据库，获取码为PRJNA392895［14］。

将原始测序数据（Raw reads）中低质量的序列读序（Reads）去除，然后使用Trinity 软件［15］组装干净读序（Clean reads），并对其进行拼接，进而获得转录本序列（transcripts）；将转录本进行同源聚类和拼接，从而得到unigene；随后利用公共数据库（Nr，Swiss Prot，KOG，Pfam，GO，KEGG）对得到的金花茶花瓣的unigene进行注释，要求E值<1E-5。

1.2 金花茶基因表达水平分析及差异表达基因的筛选

利用软件RSEM［16］，把15 个样品中的干净序列（Clean reads）与Trinity 软件拼接得到的金花茶转录组参考序列进行比对，统计在每个样品中比对到每个基因上的reads 的数目（Readcount），并将其转换成FPKM 值（expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced）［17］，分析开花过程中金花茶基因的表达水平。随后采用DESeq 软件［18］，检测不同开花时期花瓣的差异表达基因（differentially ex⁃pressed genes，DEGs），将5 个时期的金花茶花瓣转录组数据，根据开花过程的先后顺序进行两两比对，获得了S2-VS-S1、S3-VS-S2、S4-VS-S3和S5-VSS4等4个比较组，筛选其中的差异表达基因，筛选标准设为FDR≤0.001，差异倍数大于2，且Padj<0.05。

1.3 开花过程中金花茶差异表达基因的富集分析及趋势分析

对所获得的金花茶差异表达基因的GO 功能富集，主要采用GOseq 进行分析［19］；而对于所有金花茶差异表达基因KEGG 通路的富集分析，则主要采用KOBAS（2.0）来完成［20］，通过对金花茶花瓣差异表达基因的富集分析，进而挖掘开花过程中调控金花茶花瓣发育的相关基因。为了分析不同开花时期金花茶的基因表达趋势，首先，根据花朵开放的先后顺序，对5个不同开花时期的金花茶花瓣转录组数据进行两两比对；然后再利用STEM 软件［21］，对4个比较组的所有差异表达基因进行趋势分析，进而筛选显著性的基因表达集合，显著性的筛选标准为P<0.05。

1.4 开花过程中金花茶高表达基因的筛选及富集分析

为研究高表达基因在金花茶花瓣发育过程中的功能，计算每个unigene 在花瓣发育5 个时期的FPKM 平均值，将FPKM 均值大于100 的unigene 认为是高表达基因［22］；随后利用KOBAS（2.0）对高表达基因进行KEGG代谢通路富集分析。

1.5 金花茶差异表达基因的实时荧光定量PCR验证

随机选择3 个在金花茶花瓣发育中差异表达基因，使用Primer Premier（5.0）软件设计基因特异性引物，进行实时荧光定量PCR 验证。利用试剂盒（Invitrogen）将提取到的各样品RNA 反转录为cDNA，随后以cDNA 为模板，选择18S rRNA 作为内参基因，在ABI 7500FAST 荧光定量PCR 仪（ABI公司，美国）进行荧光定量检测。反应按照SYBR Green Dye 试剂盒说明书进行操作，本实验中每个样品进行3次技术重复，采用2-∆∆CT法计算差异基因的相对表达量［23］。

2 结果与分析

2.1 金花茶开花过程中差异表达基因分析

根据花朵开放的先后顺序，对5个不同开花时期的金花茶花瓣转录水平进行两两比对，4个比较组中共获得了1 922个差异表达基因（见图2）。在S2 与S1 比较组中，共检测到76 个差异表达基因；在S3 与S2 的比较组中，检测到的差异表达基因数量有较大的增加，为325个；而在S4与S3的比较组中，检测到的差异表达基因数量则最少，仅有11个；最后在S5 与S4 的比较组中，检测到的差异表达基因为1 473个，数量最多，其中870个差异表达基因上调表达，603个下调表达；结果表明，金花茶的半开期（S4）与盛开期（S5）可能是金花茶开花过程中比较关键的阶段，这两个阶段的差异表达基因可能在开花的调控机制中具有重要的作用。对4 个比较组中的1 922 个差异表达基因进行GO 功能注释，3 个一级分类单位包含37 个二级分类功能组。生物学过程中所包含的二级分类单位数量最多，有17个，差异表达基因主要集中在代谢进程（metabolic process）、单有机体进程（single-organ⁃ism process）、细胞进程（cellular process）等二级分类单位中；其次为分子功能，该分类单位主要集中在催化活性（catalytic activity）、结合（binding）、转运活性（transporter activity）等二级分类单位中；而细胞组分所含的二级分类单位则最少，且主要集中在细胞膜（membrane）、细胞膜部分（membrane part）和细胞（cell）等分类单位中。GO 功能分类结果表明金花茶花瓣差异表达基因的表达主要与代谢进程、单有机体进程、细胞进程、催化活性、结合等相关联（见图3）。

2.2 金花茶差异表达基因的富集分析

对4个比较组中获得的1 922个差异表达基因进行GO功能富集分析，3个一级分类单位，生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及 细 胞 组 分（Cellular Component，CC）分别富集到17、9、11 个二级生物过程，其中富集达到显著水平的GO 分类共有33 个，主要有水解酶活性（GO：0016787）、酶抑制剂活性（GO：0004857）、催化活性（GO：0003824）、糖类化合物代谢过程（GO：0005975）、碳—氧裂解酶活性（GO：0016838）、生物膜（GO：0016020）等（见图4）；其中二级GO 分类单元催化活性（catalytic activity，GO：0003824），它所含有的三级GO 分类单元水解酶（hydrolase activity，GO：0016787）、四级GO 分类单元糖基键水解酶（hydrolase activity，acting on glyco⁃syl bonds，GO：0016798）、五级GO 分类单元水解O-糖基化合物水解酶（hydrolase activity，hydrolyz⁃ing O-glycosyl compounds，GO：0004553）均表现为显著富集，这些分类单元包含的unigene 以木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（（Xyloglucan endotransgluco⁃sylase/hydrolase，XTH）为主，GO 功能富集分析结果表明，金花茶开花过程中差异表达基因的功能主要与糖的合成、分解与代谢，酶的活性与催化，化学键的生成与断裂，生物膜的合成以及电子载体活性有关。而1 922 个差异表达基因被富集到了77条KEGG 的Pathway 中，其中富集达到显著水平的KEGG 通路共有9个，具体的通路为类苯基丙烷生物合成（ko00940）、类黄酮生物合成（ko00941）、次生代谢物的生物合成（ko01110）、植物昼夜节律（ko04712）、油菜素甾醇生物合成（ko00905）、戊糖和葡萄糖醛酸转化（ko00040）、角质，亚氨酸和蜡生物合成（ko00073）、代谢途径（ko01100）和醚脂类代谢（ko00565）（见图5）。KEGG富集分析结果发现，金花茶花瓣差异表达基因的功能主要与次生物质代谢、激素合成与传导、糖类和脂类物质转化有关。

2.3 调控金花茶花瓣发育的基因挖掘

为寻找调控金花茶花朵开放及花瓣发育的相关基因，利用数据库对差异表达基因的功能进行注释，参考相关文献资料，总结前人的研究成果，从所有unigene中筛选出137个可能与花朵开放及花瓣发育的差异表达基因。根据它们的功能特性，137 个差异表达基因被划分为3 大类，主要涉及植物激素信号转导、转录调控、细胞伸长等调节过程。32 个unigene 与植物激素信号传导代谢调节通路有关，包括生长素信号转导通路（Auxin sig⁃naling pathways），茉莉酸信号转导通路（Jasmonic acid signaling pathways），细胞分裂素信号转导通路（Cytokinin signaling pathways），赤霉素信号转导通路（Gibberellic acid signaling pathways），乙烯信号转导通路（Ethylene signaling pathways），脱落酸信号转导通路（Abscisic acid signaling pathways）等（见图6），其中生长素信号传导通路所含的差异表达基因数量最多，有14个，其次是乙烯信号传导通路，含6 个；67 个unigene 与细胞伸长有关，主要包括扩张蛋白（Expansin）、水通道蛋白（Aquaporin）、木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶、木糖酶（Xylosi⁃dase）、纤维素合成酶（Cellulose synthase）、果胶酯酶（Pectin esterase）、果胶酶（Polygalacturonase）、果胶裂解酶（Pectate lyase）、谷氧还蛋白（Glutaredox⁃in）、GDSL 脂酶/脂肪酶（GDSL esterase/lipase），其中果胶酯酶所含unigene 的数量最多（见图7）。而与转录调控作用有关的unigene有38个，转录因子主 要 有MYB、Zinc finger protein、AP2/EREBP、MADS、bHLH 等5 个类型，其中Zinc finger protein和MYB 转录因子所含数量较多，分别有12、11 个（见图8）。此外，对调控开花网络中的关键基因，如CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）、FLOWERING LOCUS D（FD）、SHORT VEGETA⁃TIVE PHASE （SVP）、FLOWERING LOCUS C（FLC）、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）、LEAFYL（LFY）、APETALA 1（AP1）、APETALA 2（AP2）、TERMINAL FLOWER 1（TFL1）、APETALA 3（AP3）、PISTILLATA（PI）、AGAMOUS（AG）、SHATTERPROOF 1（SHP1）、SEPALLATA 3（SEP3）的表达量进行了分析，发现这些基因主要在花瓣发育的早期阶段表达，且表达量不高，成花素基因FT 基本不表达；调控花瓣发育的相关基因AP3、PI、SEP3 中度表达，表达变化水平类似（见图9）；其中只有AG、SHP1为差异表达基因，这两个基因均是在花瓣发育早期表达，后期不表达，它们可能参与了金花茶花瓣早期发育的调控。

2.4 金花茶花瓣发育过程中差异表达基因的趋势分析

对1 922 个差异表达基因进行趋势分析，发现差异表达基因可聚类为20 种基因表达模式，其中1 349 个差异表达基因在profile16、profile19、pro⁃file18、profile0、profile5等5个基因表达模式中达到了显著水平（P＜0.05），每个profile 所包含的差异表达基因数量分别为465、345、190、187、162个；此外，基因表达模式Profile19 和Profile0 的变化趋势相对简单，Profile19 为持续上调表达，Profile0 为逐步下调表达；其余3个基因表达模式的变化趋势相对复杂，Profile16、Profile18 为先上调再下调表达模式，但两者的基因上调表达的时间点以及基因下调表达程度存在差别，而Profile5 为先下调再上调，表达维持稳定一段时间后，再进行下调的基因表达模式（见图10）。对金花茶花瓣差异表达基因进行趋势分析，发现差异表达基因存在多种表达模式，表明在金花茶花朵开放以及花瓣发育中存在着复杂的调控机制。结合趋势分析结果，发现筛选获得的部分unigene 在金花茶花朵开放及花瓣发育过程中表现为持续上调或下调表达趋势，它们的变化趋势与4 个比较组中差异表达基因的变化趋势基本相符（见图11）。在植物激素信号传导、转录调控、细胞伸长等3个调节过程中，持续上调或下调表达的unigene 数量分别为9 个、12 个和27 个，且持续上调的unigene 多于下调表达的unigene 数量。在果胶酯酶、锌指蛋白和生长素信号传导通路中，含有持续上调的unigene 较多，而持续下调表达的unigene 主要集中在AP2/EREBP转录因子、木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因家族、茉莉酸信号传导通路中，这些相关的unigene可能在调控金花茶花瓣的生长发育方面具有重要作用。

2.5 金花茶花瓣中高表达基因功能分析

为研究高表达基因在金花茶花瓣发育过程中的功能，将FPKM 均值大于100 的unigene 认为是高表达基因。在金花茶花瓣转录组的unigene中，共有334个高表达的unigene，其中有31个为差异表达基因。对高表达基因进行表达聚类分析，发现这些unigene具有不同的表达方式（见图12），其中大部分unigene 只在花瓣发育的单个时期高表达，少数unigene 可在花瓣发育的早期（S1）和后期（S5）高表达。对高表达基因进行KEGG功能富集分析，共有7条KEGG 代谢通路的富集达到了极显著水平（Q<0.05），具体的通路为类黄酮生物合成（ko00941），植物昼夜节律（ko04712），吞噬体（ko04145），苯丙素生物合成（ko00940），核糖体（ko03010），戊糖和葡萄糖醛酸盐转化（ko00040），光合生物的固碳作用（ko00710）（见图13）；此外，20%的高表达unigene富集到了新陈代谢通路途径（ko01100），虽然该通路的富集程度未到达显著水平。KEGG富集分析结果发现，金花茶花瓣高表达基因的功能主要与次生物质合成、植物昼夜节律调节有关。

2.6 金花茶差异表达基因的实时荧光定量PCR验证

为验证金花茶花瓣转录组测序的准确性，将18S rRNA 作为内参基因，随机选取3 个差异表达基 因Contig18624_g1、TRINITY_DN207944_c2_g1和TRINITY_DN188579_c0_g2 进行实时荧光定量PCR 分析，它们分别被注释为丝氨酸羧肽酶（Ser⁃ine carboxypeptidase）、番茄红素-环化酶（Lycopenecyclase）、木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（见图14～16）。RT-qPCR 结果显示，在金花茶花瓣发育中3 个DEG 表达量的变化趋势与转录组测序中基因的表达量变化趋势基本符合，即这些unigene 在金花茶花瓣发育早期（S1、S2、S3）中低度表达，在花瓣发育后期（S4、S5）高度表达。金花茶花瓣的荧光定量PCR 数据表明花瓣转录组测序数据的可靠性较高。

3 讨论

花瓣是高等植物生殖系统的重要组成部分，除了保护雄蕊和雌蕊，花瓣的大小、形状、颜色和排列等特征，还可以吸引传粉昆虫，保证授粉的成功。花瓣生长的基本程序，始于花瓣原基的形成，随后进入到细胞增殖时期，然后再通过细胞扩展和分化，形成成熟花瓣器官［24］，而花瓣细胞扩展过程中会发生细胞膨压改变、细胞骨架重构、细胞壁物质降解及重新合成等生理活动［25］。双子叶植物花瓣的细胞壁主要由木葡聚糖和纤维素构成，并通过结构蛋白进行交联。花瓣发育过程中，细胞增大依赖于内糖苷酶、糖基转移酶、水解酶、扩展蛋白和这些酶的共同作用［26］。对金花茶花瓣4 个比较组中差异表达基因的GO 富集分析结果与上述观点相符，金花茶开花过程中GO 分类表明差异表达基因主要与纤维素代谢，葡聚糖合成与分解，化学键生成与断裂，生物膜的合成以及电子载体活性有关；另外，发现许多对细胞增大有促进作用的水解酶、聚半乳糖醛酸酶、转移酶都被富集到了GO 分类中，并且达到了显著水平；其中二级GO 分类单元催化活性（GO：0003824），它所含有的三级GO 分类单元水解酶（GO：0016787）、四级GO 分类单元糖基键水解酶（GO：0016798）、五级GO 分类单元水解O-糖基化合物水解酶（GO：0004553）均表现为显著富集，这些分类单元包含的unigene 以木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）为主，该蛋白为多基因家族，在植物细胞生长过程中XTH 是植物细胞壁重构过程中的关键酶之一，不但可以松弛和合成细胞壁，还能强化细胞壁；另外还具有降解细胞壁的功能［27～28］。而金花茶花瓣4 个比较组中差异表达基因的KEGG 富集分析，发现差异表达基因主要富集在次生物质代谢、激素合成与传导、糖类和脂类物质转化等代谢通路中，而在深山含笑（Michelia maudiae）［29］、薰衣草（Lavandula an⁃gustifolia）［30］、茶 树（Camellia sinensis）［31］、菊 花（Chrysanthemum morifolium）［32］等其他植物的花瓣富集分析中，也存在类似的结果。

对金花茶花瓣的差异表达基因进行功能注释，共获得10 大类与花瓣发育有关的下游功能基因，其中木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）、果胶酯酶（PE）等功能基因所占比例较大，验证了金花茶花瓣中差异表达基因GO 富集分析的结果。本研究鉴定出了9 个XTH 基因，在金花茶花朵开放过程中，它们的表达变化趋势存在一定差异，其中4 个XTH unigene 在花朵开放过程中持续上调表达，而另外3个则持续下调。与拟南芥、月季、康乃馨等XTH 基因的表达情况进行比较，发现金花茶XTH 基因的表达量、表达部位与上述植物不尽相同。 如TRINITY_DN185804_c2_g1 被 注 释 为AtXTH33，主要在金花茶成熟花瓣中高表达，而拟南芥AtXTH33 在花发育中期的花药中进行表达。Contig15598_g1 和TRINITY_DN193129_c4_g1 这两个unigene被注释为AtXTH2，TRINITY_DN20353 9_c1_g3 被注释为AtXTH3，在金花茶花瓣发育过程中它们持续下调表达，但在玫瑰花中的RbXTH2能被乙烯诱导表达，在花瓣脱落中具有促进细胞分离的功能［33］；在拟南芥中AtXTH3 在绒毡层细胞壁中专一性表达，可降解绒毡层细胞壁［34～36］；而在康乃馨中DcXTH2 和DcXTH3 基因却在开放的花瓣中大量表达，很可能促进了花瓣的生长发育［37］。根据unigene 表达量的变化情况进行推测，在金花茶花瓣发育过程中表达量趋势上调的4 个XTH 基因可能起到了正调控作用；而表达量趋势下调的基因可能具有负调控作用，但其具体功能仍需进一步研究。

研究中还发现，在金花茶花瓣发育过程中，有6条激素转导通路含有差异表达基因；这些差异表达基因主要分布在生长素信号转导途径、乙烯信号转导途径、茉莉酸信号转导途径等3条植物激素转导途径中。生长素在调节植物从胚胎发生到成熟的生长进程中具有决定性作用［38］，而本研究中金花茶花瓣的生长素信号转导通路含有的差异表达基因数量最多，共有14 条；其中1 条unigene 被注释为AUX1 共转运体（AUX1/LAX），6 条unigene被 注 释 为AUX/IAA 基 因，7 条unigene 被 注 释 为SAUR 基因，AUX1/LAX 是生长素运入载体，AUX/IAA 和SAUR 基因都属于生长素早期反应基因，它们对生长素起重要调节作用。此外，还发现注释为AUX/IAA 和SAUR 的unigene 主要在完全开放的成熟花瓣中高表达，有5 条unigene 的表达量随花瓣发育持续上调表达，根据参与生长素信号转导基因的表达量推断，它们可能在决定和维持花瓣中发挥着积极的作用。该结果与Han 等在月季花瓣发育的转录组研究［12］以及花瓣近轴面和远轴面细胞的转录组研究结果类似［39］，月季花瓣发育中生长素信号转导通路也存在大量高表达的差异表达基因。金花茶花瓣发育过程中，发现乙烯信号转导途径也存在较多的差异表达基因；有研究表明，生长素与乙烯可以协同作用，调节根的伸长、叶片发育和许多其他生理过程［40～41］。金花茶花瓣发育过程中是否存在生长素与乙烯协同作用，调节花瓣发育，这个问题还有待进一步研究。

在金花茶花瓣发育的各个阶段，表达水平具有较大变化的转录因子有MYB、bHLH、AP/EREBP、MADS、Zinc finger protein。MYB 转录因子是植物转录因子中最丰富的类群，具有调节植物发育、次生代谢物质合成、激素信号转导、增强植物抗性等作用［42］。本次金花茶花瓣转录组分析，也发现了许多MYB 转录因子，其中TRINI⁃TY_DN182693_c0_g1 和TRINITY_DN197357_c2_g 3，这两个unigene 分别被注释为AtMYB17 和At⁃MY105。此前有研究报导，拟南芥AtMYB17 主要在茎尖、幼嫩的花蕾、发育的心皮和纤毛［43］、花分生组织中表达，可使植物从营养生长向生殖生长转变，起始花原基的生成及促进植物开花［44］；金花茶中TRINITY_DN182693_c0_g1 只在幼嫩的花蕾期（S1）高表达，与拟南芥AtMYB17 在花组织中的表达特征类似，但其是否具有促进植物成花转变的功能仍有待深入研究。而拟南芥AtMYB105 主要在植物器官的边缘表达，具有调控侧生器官的发育及形成、腋生分生组织发育的功能［45］，与At⁃MYB105 同源的基因TRINITY_DN197357_c2_g3在金花茶开放的前四个时期中度表达，因此推测该基因对于维持金花茶花瓣的形状及大小，可能具有重要的调节功能。此外，属于bHLH转录因子的TRINITY_DN194462_c2_g2 和Contig2515_g1，被注释为AtBPE（BIGPETAL）基因，它们在金花茶花瓣发育的不同阶段中低度表达；目前，已有研究表明拟南芥的BPEp 基因主要在花瓣中特异性表达，其突变体的花瓣表面积比野生型更大，该基因可抑制细胞体积扩增来调控花瓣形状的大小［46］；根据这两个unigene 的表达量及其同源基因的已知功能，推测它们可能在调控金花茶花瓣大小上具有重要作用。

本研究对金花茶花瓣转录组中高表达基因进行表达聚类分析，发现大部分unigene 只在花瓣发育的单个时期高表达，因此推断这些unigene 主要在特定时期来调控金花茶花瓣的发育；高表达基因KEGG 富集分析结果发现，金花茶花瓣高表达基因主要与次生物质合成有关，该结论与金花茶花瓣中差异表达基因KEGG 富集分析结果类似。这些在花瓣中高表达的基因和差异表达基因可能对金花茶花瓣内次生代谢物质的合成具有调控利用。在金花茶花瓣转录组的高表达基因中，有31个为差异表达基因，与花瓣发育有关的unigene 有TRINITY_DN190714_c3_g1、TRINITY_DN210333_c3_g6、TRINITY_DN198980_c0_g7，它们分别被注释为GDSL 酯酶/脂肪酶、果胶酯酶、果胶裂解酶；另外，高表达基因中与花瓣发育调控的基因主要涉及植物激素信号转导、转录调控、细胞伸长等3个调节过程，与细胞伸长有关的功能基因主要是水通道蛋白（Aquaporin protein，AQP）。植物水通道蛋白是重要的多功能膜蛋白，在物质转运、种子萌发、蒸腾作用、光合作用、气孔调节及抗逆应答等过程中起重要作用［47］。目前，Ma 等已研究证实月季的水通道蛋白RhPIP2；在花瓣表皮细胞中高度表达，表达模式与开花周期类似，该蛋白具有促进花瓣细胞扩张，使花瓣伸长的功能［48］。综合水孔通道蛋白在金花茶花瓣中的高表达量及其同源基因的已知功能，推测水孔通道蛋白，特别是被注释为PIP 类型水通道蛋白的unigene（TRINI⁃TY_DN208396_c4_g1），可能在调控金花茶花瓣形状上具有重要作用。

植物开花是营养生长向生殖生长变化的过程，主要分为成花决定、花的发端、花器官发育等3个阶段［49］，由开花调控相关基因CO、FT、SOC1、LFY、AG、TFL1、SEP3、AP1 等组成调控网络，进行精细的控制［50-52］；花器官发育的ABCDE 模型中，主要由A类基因（AP1）、B类基因（PI，AP3）、E类基因（SEP）调控花瓣的形成［53］，当这些基因发生突变时，会导致花瓣的错位发育［54］。本次实验选取了花瓣原基形成后不断伸长的花瓣作为研究对象，对调控花瓣形成相关基因的表达量进行了分析，发现金花茶的PI、AP3、SEP 基因表达水平相似，而B 类基因AP3、PI 结合为异源二聚体后，才能和SEP/AP1 形成四聚体决定花瓣的发育［55］，因此推测蛋白之间的互作，使PI、AP3、SEP 等基因的表达水平类似。模式植物的研究表明，调控花器官发育的MADS-box 基因的功能与其表达模式高度相关，所以在非模式植物中，可以利用MADS-box 基因表达模式对它们的功能来进行预测［56］。此外，Sablowski等发现AP3/PI的异源二聚体可以直接调节NAP（NAC-LIKE，ACTIVATED BY AP3/PI）基因，而NAP 在花发育中的花瓣和雄蕊中表达，其表达与花瓣和雄蕊组织由细胞分裂到细胞膨大的转变有关［57］；刘志雄等对大花惠兰（Cymbidium faberi Rolfe）CyfaPI 基因功能研究，发现转化35S：：Cyfa⁃PI 的拟南芥中，PI/pi-1 杂合子背景下的转基因拟南芥的一个株系产生了较大的花［58］，上述研究表明B类基因，如PI、AP3，对于花型及花瓣大小的调控可能起到重要的作用。金花茶的AP1、PI、AP3、SEP 基因都属于MADS-box 转录因子，在金花茶花瓣发育过程中基因PI、AP3、SEP 的表达趋势类似，它们主要在花瓣发育的早期和中期中度表达，在盛开的花瓣（S5）中不表达，因此它们可能参与了金花茶花瓣早中期发育的调控，但它们具体的调控机制仍有待揭示。

4 结论

本研究利用RNA-seq 技术分析了金花茶花瓣发育过程中转录组的动态变化GO 富集分析发现，金花茶开花过程中差异表达基因的功能主要与糖的合成、分解与代谢、酶的活性与催化、化学键的生成与断裂、生物膜的合成以及电子载体活性有关。KEGG富集分析结果表明，金花茶花瓣差异表达基因的功能则主要与次生物质代谢、激素合成与传导、糖类和脂类物质转化有关。金花茶花瓣差异表达基因涉及6条激素信号转导通路，其中生长素转导途径所含差异表达基因数量最多，部分AUX1/LAX 共转运体、AUX/IAA 基因、SAUR 等生长素应答基因在开花过程中明显上调，表明生长素可能对于调控金花茶花瓣发育具有重要的作用；部分转录因子及下游功能基因MYB、bHLH、锌指蛋白、木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶、果胶酯酶、果胶裂解酶等，它们的表达量呈现显著变化，其中XTH 显著富集于GO分类中的水解酶活性，因此推断这些基因可能在金花茶花瓣发育过程中具有重要的调控作用。此外，本研究分析了FT、SOC1、AP3、PI、SEP3 等开花调控关键基因在金花茶花瓣发育过程中主要以中低表达为主。KEGG 富集分析结果表明，金花茶花瓣高表达基因主要与次生物质合成有关。这些结果为进一步研究金花茶花瓣发育的调控机制奠定了理论基础。