糖盐介质中γ-射线辐照对英诺克李斯特菌的杀菌效果研究

徐毓谦 李淑荣 李文慧 王 丽 黄广学 汪慧华 马长路

(1北京农业职业学院，北京 102442；2宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021)

目前，近70%的食源性疾病是由食品中微生物污染造成的，其中主要是致病性微生物，所以控制食品中致病性微生物污染是减少食源性疾病和提高食品安全性的重要途径[1-3]。常见的热杀菌技术和防腐剂在保证食品安全上具有重要的作用，但热杀菌对食品原有的口感和风味有较大影响，还会破坏部分营养物质；且过量使用防腐剂也会对人体产生一定的危害[4-5]。冷杀菌技术能较好地保持食品原有的风味[6-9]，而辐照技术是最为安全有效和简便的食品冷杀菌冷处理方法之一[8-10]，目前已经成为一种成熟的食品杀菌技术[9-14]。

食品中的英诺克李斯特菌(Listeria Innocua)对人类有一定的潜在致病性[15-17]。刘超超等[18]利用γ-射线辐照鲜切苦瓜，发现0.52～1.86 kGy 剂量辐照处理对英诺克李斯特菌具有显著的灭菌效果，D10值为0.29 kGy；张春红等[19]研究发现γ-射线辐照对生湿面条中细菌和霉菌的杀菌效果显著，D10值分别为1.37 和2.22 kGy。

辐照杀菌效果受多种因素影响[20]，如射线的类型、初始菌含量、微生物对辐照的耐受性、含氧量、含水量、温度以及介质中的营养成分等，尤其是介质的营养成分对杀菌效果影响十分显著。Kazi 等[21]研究发现，在磷酸缓冲液、肉汤、鸡肉3 种不同基质中，辐照处理杀灭鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的D10值分别为0.20、0.57 和0.53 kGy，K1-2B 株菌的D10值分别为0.21、0.40 和0.32 kGy；Thayer 等[22]利用蛋白胨和鸡肉作为基质，培养4 种金黄色葡萄球菌的混合菌株，D10值分别为0.10 和0.47 kGy。这可能是由于不同基质对致病微生物提供的保护作用不同，使菌株D10值产生差异[23-24]。

盐和糖是食品基质中的主要配料，目前尚鲜见关于其对辐照杀菌效果影响的报道。本试验探究不同糖浓度和盐浓度对辐照杀菌效果的影响，以期为明确影响辐照杀菌效果的因素和杀菌的机制提供依据，为调整产品的加工工艺，有效降低产品的吸收剂量，节约成本，更好地保障产品的质量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

英诺克李斯特菌，上海北诺生物科技有限公司。

胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(tryptone soya yeast extract agar，TSAYE)、含6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(tryptic soy broth with yeast extract，TSBYE)，北京陆桥技术有限责任公司；氯化钠(化学纯)，北京化学试剂公司；白砂糖，当地超市。

1.2 仪器与设备

MVS-83 立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Sigma 3K15 超低温台式离心机，西安恒科商贸有限公司，LRH-150 生化培养箱，上海一恒科技有限公司；SCW-SP-650W/SCW-CZ-650V 洁净工作台，北京冠鹏净化设备有限责任公司；JA1103 电子天平，余姚纪铭称重校验设备有限公司；FA2204B 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；THZ-C 培英恒温振荡器，太仓市实验设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 取一环甘油中保存的菌种用五步划线法在TSAYE 上划线，37℃培养18 ～24 h 后，挑取一个单独菌落接于20 mL TSBYE 中，37℃振荡培养18～24 h，然后以5%的接种量接于100 mL TSBYE 中，37℃振荡培养24 h[25]。备用。

1.3.2 菌种培养 取活化后的菌以5%的接种量接于TSBYE 中，37℃静置培养8 h，备用。

1.3.3 样品制备 取培养8 h 的菌种培养液1 000 mL，经8 000 r·min-1、4℃离心10 min，无菌水洗2 次，分别将无菌水、3%、5%、8%的糖溶液以及0.85%、3%、5%的盐溶液分别与菌体充分混匀，制成浓度为108个·mL-1的菌悬液，分装于10 mL 离心管中，以备辐照。

1.3.4 辐照方法 本试验的γ-射线辐照处理在中国农业科学院原子能利用研究所进行，辐射源源强为1.5×105Ci，剂量率约20 Gy·min-1。电子束辐照在中国原子能研究院进行，电子束功率10 kW，能量5 MeV，扫描宽度50 cm，扫描速度1.5 m·min-1。

先使用不同剂量的γ-射线和电子束辐照分别处理无菌水组的英诺克李斯特菌，根据结果选择较优辐照源类型。采用5 个辐照处理剂量，分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 kGy，未辐照样作为对照，每个辐照剂量重复4 次，辐照处理后放入-4℃冰箱中保存备用。

1.3.5 菌落计数培养

将辐照后(包括对照组)的菌悬液进行梯度稀释，取1 mL 合适的稀释液加入培养皿中，再倒入45℃的TSBYE，混合均匀，37℃培养48 h，然后计菌落数[26]。分别选3 个合适的连续的稀释梯度取稀释液，每个梯度2 个平行。

1.3.6D10值的测定 通常微生物含量与吸收剂量之间遵循式(1)[25]:

式中，D为吸收剂量，kGy；N0为微生物的初始含量，CFU·mL-1； N 为辐照后微生物的存活数，CFU·mL-1；D10值是指杀灭90%微生物所需的吸收剂量，即为辐照剂量与存活菌数对数拟合的线性方程的斜率。

1.4 数据处理方法

利用软件Excel 2013 进行数据处理和绘制图表。采用SPSS 21 软件对所得数据进行分析，采用Duncan法进行多重比较，P＜0.05 为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 辐照剂量及射线类型对英诺克李斯特菌辐照杀菌效果的影响

由表1 可知，随着辐照剂量的增加，2 种辐照处理的菌悬液中菌的存活数降低，说明辐照可以有效地杀灭致病菌，这与刘超超等[18]和杜晓静等[27]的研究结果相一致。利用lgN-D 线性回归分析，对辐照剂量和菌落存活数进行拟合，得到辐照剂量-菌落存活数的拟合方程(图1)。由此推算，在无菌水作为辐照杀菌的液体环境条件下，γ-射线和电子束辐照杀灭英诺克李斯特菌的D10值分别是0.788 和0.872 kGy(图2)，γ-射线的D10值比电子束小，即杀灭同样数量的菌体电子束需要的剂量更大，由此得出γ-射线的杀菌效果比电子束相对较好，这与徐远芳等[28]和王晶晶等[29]的研究结果相吻合。因此后续试验将使用γ-射线进行辐照处理。

2.2 不同盐浓度对英诺克李斯特菌γ-射线辐照效应的影响

致病菌在不同盐浓度和不同辐照剂量样品中的菌落存活数见图3。对图3 数据进行盐浓度和辐照剂量两者间的主效应分析(表2)，结果表明辐照剂量对菌落存活数存在极显著的影响(P＜0.01)。分析图3 可以看出，在同等盐浓度下，随着辐照剂量的增大，英诺克李斯特菌的存活数逐步下降；盐浓度对溶液中英诺克李斯特菌存活能力的影响规律受辐照剂量影响，即当辐照剂量低于1.0 kGy 时，对于辐照同一剂量的英诺克李斯特菌，各盐浓度间及与无菌水组之间的辐照杀菌效果无明显差异；当辐照剂量高于1.5 kGy 时，无菌水组菌的存活数与各盐浓度之间的差异显著，当辐照剂量为1.5 kGy 和2.5 kGy 时，随着盐浓度的增加溶液中的活菌数呈下降的趋势；当辐照剂量为2.0 kGy 时，呈波动状态，关于这一趋势尚待进一步研究。

表1 不同辐照剂量处理后菌落存活数的对数Table 1 Logarithm of survival number of bacteria treated with different irradiation doses

图1 不同辐照剂量处理后平板培养存活数的拟合方程Fig.1 Fitting equation of survival number of plate culture with differentirradiation doses

图2 无菌水作为辐照液体环境时2 种射线D10值的比较Fig.2 Comparison of D10 values of two kinds of radiation in water as irradiation liquid environment

图3 不同辐照剂量处理后英诺克李斯特菌存活数随盐浓度的变化Fig.3 The varies of survival number of Listeria Innocua by irradiation with the concentration of salt

利用辐照剂量和液体中英诺克李斯特菌存活数的线性方程计算不同盐浓度中致病菌英诺克李斯特菌的D10值(图4、表3)，随着盐浓度的增加，D10值呈先增加后降低的趋势，即杀灭生理盐水(0.85% NaCl)中致病菌英诺克李斯特菌的D10值与无菌水组无明显差别，而3%和5%盐浓度样品的D10值与无菌水组样品差异显著(P＜0.05)，表明高浓度盐水中的英诺克李斯特菌对γ-射线辐照更为敏感，高浓度盐的存在对致病微生物的辐射杀菌有协同作用。

表2 辐照剂量及盐浓度对菌落存活数的主效应分析Table 2 The main factor effect analysis of irradiation doses and salt on bacteria survival

表3 γ-射线辐照不同盐浓度中致病菌D10值Table 3 D10 values of bacteria in different salt concentrations irradiated by γ-ray

图4 盐浓度对菌落数和线性拟合方程的影响Fig.4 Effect of salt concentration on the number of Listeria Innocua and the linear fitting equation

2.3 不同糖浓度对英诺克李斯特菌γ-射线辐照杀菌效应

致病菌在不同糖浓度和不同辐照样品中的菌落存活数见图5。对图5 数据进行糖浓度和辐照剂量两者间的主效应分析(表4)。结果表明，辐照剂量和糖浓度对于菌落存活数影响极显著(P＜0.01)。由图5 可知，随着辐照剂量的增加，不同糖浓度中英诺克李斯特菌的存活数逐步降低；在不同辐照剂量下，糖浓度对γ-射线辐照后英诺克李斯特菌的存活数影响变化趋势一致，呈先增加后降低的趋势，且5%糖溶液中活菌数最多；当辐照剂量大于2.0 kGy 后，糖溶液中的活菌数高于无菌水组。

根据辐照剂量和溶液中英诺克李斯特菌存活数的线性拟合方程计算不同糖浓度中的致病菌英诺克李斯特菌的D10值(图6、表5)。随着糖浓度的增加，D10值呈先上升后略下降的趋势，最大值出现在5%糖浓度时，且糖浓度中英诺克李斯特菌的D10值高于无菌水组。说明在辐照条件下，糖的存在可以保护致病菌英诺克李斯特菌，导致杀灭英诺克李斯特菌所需的剂量增加。

表4 不同辐照剂量及不同糖浓度对菌落存活数的主效应分析Table 4 The main factor effect analysis of different irradiation doses and different sugar concentrationon bacteria survival

表5 γ-射线辐照不同糖浓度中致病菌D10值Table 5 D10values of bacteria in different sugar concentrations irradiated by γ-ray

图5 不同辐照剂量后处理英诺克李斯特菌存活数随糖浓度的变化Fig.5 The varies of survival number of Listeria Innocua by irradiation with the concentration of suger

图6 糖浓度对菌落数和线性拟合方程的影响Fig.6 Effect of sugar concentration on the number of Listeria Innocua and the linear fitting equation

3 讨论

研究表明不同基质造成同一菌株D10值差异的主要原因是不同基质对致病微生物提供的保护作用不同[21]，因为辐照对致病微生物的杀伤作用主要是通过水离子化产生的初级自由离子及由此产生的二级离子引起的。肉汤、肉类等有机物的系统中含有大量的巯基、氨基酸、磷脂类等保护致病微生物的物质，辐照产生的一级、二级辐照产物首先会与这些有机物发生反应，生成对致病微生物无抑制作用的终产物[22-23]，故减弱了辐照对致病微生物的杀灭作用。

本研究中，致病菌英诺克李斯特菌在盐溶液和糖溶液中对辐照的敏感性不同，盐溶液对辐照杀菌效果有一定的协同作用，这可能是NaCl 溶液在辐照过程中形成了次氯酸钠(NaClO)，生成的NaClO 有较强的氧化性，具有漂白与杀菌的作用。在盐溶液中，随着盐浓度的增加，D10值呈先增加后降低趋势，即在0.85%浓度下对致病菌英诺克李斯特菌的D10值稍高于无菌水组，但无明显差别，这可能是由于NaCl 含量低，溶液中的Cl-或生成Cl2量少，溶液中产生的NaOH 量也少，且二者反应不充分，或者溶液中所生成的NaClO 含量较低；而在高浓度盐溶液中(3%和5%)，对致病菌英诺克李斯特菌的D10值明显低于无菌水组，这可能是由于在辐照射线的作用下，H2O 解离成H＋和OH-，水溶液中会有NaOH 产生，其与溶液中的Cl-或产生的Cl2发生反应，形成具有强氧化性的NaClO，因此高浓度的NaCl 对致病微生物的辐射杀菌有协同作用。

糖作为碳源为微生物提供了足够的营养成分，其中以葡萄糖为主，为致病微生物提供了良好的碳源和能量，使微生物能够生长和繁殖[30-31]，如李斯特菌属于嗜冷菌，即使在低温条件下也能进行缓慢增长。因此，在糖浓度适宜的情况下，糖的存在促进了菌体的生长。本研究发现2.0 kGy 以上剂量辐照处理对菌体细胞的损伤较大，但有糖存在的条件下，有利于受损细胞的修复，因此，出现了含糖溶液中的菌落存活数明显高于无菌水组的数量。

本研究发现糖溶液对辐照杀菌具有一定的保护作用，有葡萄糖存在时，对致病菌英诺克李斯特菌的D10值明显高于无菌水组，并且随着糖浓度的增加，D10值呈先增加后略降低的趋势。这可能是由于适宜糖浓度条件提高了微生物的生长能力，及其对不良环境的抵抗能力；且本研究发现在5%糖溶液条件下，D10值最大，说明此浓度的糖溶液使致病菌英诺克李斯特菌处在较适宜的环境中，而在8%的糖浓度条件下，D10值出现略微下降的趋势，这可能是由于培养液中葡萄糖浓度过高时，细胞会渗透失水，导致致病菌失水过多死亡，从而抑制微生物的生长。

4 结论

本研究结果表明，辐照处理能有效杀死致病菌英诺克李斯特菌，且随着辐照剂量的增加，杀菌效应越明显；相比于电子束辐照杀菌效果，γ-射线辐照杀菌的D10值更低，即γ-射线辐照杀菌的效果更好；盐溶液浓度在0～5%范围内，在γ-射线辐照下，随着盐浓度的增加，D10值呈先增加后降低的趋势，且盐浓度为3%和5%时的D10值低于无菌水，说明盐溶液对杀菌有协同作用；糖浓度在0～8%范围内，在γ-射线辐照下，随着糖浓度的增大，D10值先增加后降低，5%糖浓度时的D10值最大，为1.133，糖对英诺克李斯特菌的保护作用增加了辐照杀菌的难度。本研究结果进一步说明食品基质对致病微生物的杀菌效果具有明显的影响。