几丁质降解菌的分离鉴定与产酶条件探究

王 敏，辛二娜，王 瑶，张天宝，郭继虎，杜慧玲

（山西农业大学基础部，山西太谷030801）

几丁质（Chitin），又称甲壳素，是微生物、绿色植物细胞壁以及甲壳类动物外壳的主要成分[1-2]，是纤维素之外的第二大天然大分子物质，也是自然界唯一的碱性多糖[3-4]。几丁质降解后形成的N- 乙酰氨基葡萄糖、几丁寡糖等，具有免疫调节、抗虫害、保湿等生物学功能，在医学、农业、化妆品等行业具有较大的应用价值[5-7]。

几丁质的化学性质稳定，不易降解，很难被有效利用。目前，降解几丁质的常用方法有化学法和酶解法。其中，化学法反应条件剧烈，产物聚合度差，容易破坏环境；酶解法反应条件温和，便于操作，是一种理想的、绿色的降解几丁质的方法[8-9]。1905 年BENECKEU 首次从几丁质酶芽孢杆菌中分离发现了一类将几丁质降解为N- 乙酰氨基葡萄糖单体的几丁质酶[10]。随着人们对几丁质酶研究的深入，现已在许多微生物中发现了几丁质酶[11]。刘蒲临等[12]从侧孢短芽孢杆菌分离出几丁质酶，并对其产酶发酵条件进行了优化。陈立功等[13]从渤海海域淤泥中筛选出一株产几丁质酶的发光杆菌。王晓辉等[14]从黄河沿岸的土壤中分离出1 株降解几丁质的地衣芽孢杆菌。郝之奎等[15]从浙江剑门港海区淤泥中筛选出几丁质酶生产菌，经分子生物学鉴定其为芽生杆菌。

随着资源昆虫的开发与利用、黄粉虫饲养规模的扩大，在为人们带来巨大效益的同时，产生了大量难以被利用的黄粉虫虫蜕，而黄粉虫虫蜕的主要成分是几丁质[16]。

本研究以自然条件下填埋黄粉虫虫蜕1 a 的土壤为材料，采用透明圈法初筛和摇瓶复筛获得1 株产酶活性较高的菌株，并对其进行形态学观察和分子生物学鉴定及最佳产酶条件的单因素优化，旨在为酶解法降解几丁质提供理论和实践指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 供试菌种来源于自然条件下填埋黄粉虫虫蜕1 a 的土壤。

1.1.2 培养基 几丁质培养基100 mL：胶体几丁质20 mL、KH2PO40.03 g、K2HPO40.07 g、FeSO40.001 g、MgSO40.05 g、NH4Cl 0.01 g、NaCl 0.01 g、琼脂2 g、水80 mL。发酵培养基100 mL：KH2PO40.03 g、K2HPO40.07 g、FeSO40.001 g、MgSO40.05 g、胶体几丁质20 mL、NH4Cl 0.01 g、NaCl 0.01 g、水80 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的筛选 初筛。称取10.0 g土壤于250 mL三角瓶，加入90 mL 无菌水，在30 ℃、180 r/min 条件下振荡180 min；然后将此土壤悬浊液依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的浓度，取10-5、10-6、10-7浓度的土壤稀释液各200 μL 涂布于几丁质培养基平板上，置于37 ℃恒温培养7 d，挑取有透明圈的单菌落进行平板划线培养。

复筛。挑取等量的一环新鲜的几丁质降解菌的单菌接种于等量的发酵培养基中，在30 ℃、180 r/min条件下，恒温培养48 h 后，用铁氰化钾（Sachales）法[17]测定酶活，取酶活性最高者作为目标菌种。

1.2.2 菌株的形态学观察 将目标菌种分别划线培养和点接在几丁质培养基平板上，于30 ℃培养48 h 后观察菌落形态特征，培养7 d 后观察菌落周围的透明条带。参照刘春爽等[18]的方法，对菌株进行革兰氏染色反应，光学显微镜（400×）下进行观察。

1.2.3 菌株分子生物学鉴定 提取菌株总DNA，用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物扩增菌株的16S rDNA 序列。PCR 反应体系为：DNA 20 ng/μL、Taq聚合酶5 U/μL、dNTP（10 mmol/L）各1 μL，27F 引物、1492R 引物各1.5 μL，10×Buffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃终延伸7 min，于4 ℃保存。PCR 产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，将测序结果和NCBI 数据库中的数据进行比对分析并构建系统发育树。

1.2.4 菌株产酶条件探究 对菌株的培养条件如发酵时间、装液量、培养基pH、培养温度、碳源及其添加量等进行单因素试验，采用铁氰化钾法[17]测定酶活，探究菌株产酶的最佳条件。

1.2.4.1 发酵时间 将几丁质降解菌接种到装液量为30 mL，pH 值7，2 g/L 的胶体几丁质为唯一碳源的150 mL 三角瓶中，置于30 ℃、180 r/min 条件下培养，培养120 h，期间每隔12 h 测定一次酶活。

1.2.4.2 装液量 在最佳培养时间下，将几丁质降解菌接种到装液量分别为10、20、30、40、50、60 mL的150 mL 三角瓶，其他培养条件同1.2.4.1，并测定酶活。

1.2.4.3 培养基pH 值 在最佳培养时间和装液量条件下，将几丁质降解菌接种到pH 值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的培养基上，其他培养条件同1.2.4.1，并测定酶活。

1.2.4.4 培养温度 在最佳培养时间、装液量和pH条件下，将几丁质降解菌接种到发酵培养基上，分别在10、20、30、40、50 ℃条件下恒温培养，其他培养条件同1.2.4.1，并测定酶活。

1.2.4.5 碳源种类 在最佳培养时间、装液量、pH值和培养温度条件下，将几丁质降解菌接种到分别以2 g/L 细粉几丁质、羧甲基纤维素、蔗糖、N- 乙酰氨基葡萄糖、胶体几丁质、可溶性淀粉、葡萄糖等为唯一碳源的发酵培养基上，测定酶活。

1.2.4.6 碳源添加量 在以上最佳条件下，将几丁质降解菌接种到胶体几丁质添加量分别为1、2、4、6、8、10 g/L 的发酵培养基上，恒温培养测定酶活。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0 进行数据统计分析，采用Microsoft Office 作图。

2 结果与分析

2.1 几丁质降解菌的筛选和形态学观察

初筛得到3 株有透明圈的菌落（图1-A），经过纯化得到1 株产酶能力良好、酶活为0.026 U/mL 的菌株，将该菌株命名为Wn；培养48 h 后，在几丁质培养基平板上对菌株Wn 进行观察，结果显示，其为圆形菌落，表面光滑，半透明，中心凸起，易于挑起（图1-B）；培养7 d 后，在几丁质培养基平板上，Wn 单菌落周围可见明显的透明圈（图1-C）；该菌株经革兰氏染色后于光学显微镜（400×）下观察呈紫色，有芽孢，确定为革兰氏阳性菌（图1-D）。

2.2 几丁质降解菌的分子生物学鉴定

以菌株Wn 的16S rDNA 序列为基础，PCR 产物（图2-A）可见Wn 的16S rDNA 序列在1 000～2 000 bp。测序结果通过在NCBI 上BLAST 比对构建系统发育树，结果如图2-B 所示，Wn 菌株和类芽孢杆菌的匹配率最高，同源性在99%以上，鉴定菌种Wn 为类芽孢杆菌属（Paenibacillussp.）。

2.3 产酶条件优化

6 个产酶条件的单因素优化结果表明（图3），培养96 h 时菌株酶活最大，为0.065 U/mL；装液量为50 mL，达1/3 时酶活最大，约0.072 U/mL；pH 值为7.5 时酶活最大，约0.073 U/mL，且与pH 值为8 时的酶活差异不显著；温度为30 ℃时的酶活最大，为0.074 U/mL；以胶体几丁质为唯一碳源的酶活最大，为0.077 U/mL；碳源添加量为8 g/L 时酶活最大，为0.155 U/mL，且与添加量为10 g/L 时的酶活差异不显著。总体来看，除碳源种类外，其余5 个单因素试验中酶活均随变量的增加而呈现先升高后降低的趋势。由菌株培养时间可知，培养96 h 后菌株产酶能力逐渐减小，这可能是因为随着培养时间的延长，营养物质逐渐被消耗，不能满足菌株大量繁殖的需要；从适宜装液量和pH 可见Wn 为需氧型菌种，且在微碱性环境种产酶效果好；不同种类的碳源对产酶能力的影响表明，几丁质酶是诱导酶，而且酶活性与几丁质的状态有关，胶体几丁质的诱导效果大于细粉几丁质的诱导效果。

3 结论与讨论

从黄粉虫中提取的几丁质及加工后的产品无毒害性，是一种环保材料[19]。但养殖废弃物中黄粉虫虫蜕的几丁质因化学性质稳定而难被有效利用，自然环境填埋的黄粉虫虫蜕的降解主要由微生物来完成，因此推测填埋黄粉虫虫蜕的土壤中存在着产几丁质酶菌株。本研究从填埋黄粉虫虫蜕的土壤中筛选几丁质降解菌Wn，通过扩增菌株的16S rDNA序列构建系统发育树，鉴定其为类芽孢杆菌属。与研究发现蟹壳土壤中[20]和玉米秸秆中[21]筛选到的几丁质降解菌多为芽孢杆菌属的结果一致。

对黄粉虫虫蜕废弃物的利用，不仅要求筛选到优质的产酶菌种，还需要对该菌种的产酶条件进行优化，最大程度地挖掘其产酶潜力。本试验通过单因素试验得出，当菌株发酵的装液量为50 mL，达1/3、添加8 g/L 的胶体几丁质为唯一碳源、pH 值7.5、置于30 ℃恒温发酵96 h 时的酶活性最大，为0.155 U/mL。袁淑博等[22]研究发现，黏质沙雷氏菌MEW06 在pH 值7、温度31 ℃、以8 g/L 的胶体几丁质为唯一碳源、培养48 h 时，菌株产生的几丁质酶活力最高。苗飞等[23]筛选出1 株几丁质降解菌WY产酶的最适条件为培养温度40 ℃、培养时间72 h、培养基中胶体几丁质含量1.62%。本试验研究结果与前人存在一定差异，可能与菌株的来源等因素有关。此外，几丁质酶活性测定的方法、选用的底物不同，所报道的产几丁质酶菌株的酶活性大小也不尽相同[24]。有研究表明，最优条件下培养的鞘氨醇杆菌J4 和芽孢杆菌J17 酶活分别可达5.43、4.8 U/mL[25]；枯草芽孢杆菌BS-1 优化培养后酶活为3.23 U/mL[21]；嗜水气单胞菌SWCH-6 酶活最高可达0.39 U/mL[26]。研究还发现，几丁质酶是一类差异较大的水解酶类，随菌种来源不同，酶学性质存在一定的差异[27]。几丁质酶对底物的亲和力不同，本试验测定酶活力选用的底物是胶体几丁质，还需进一步使用黄粉虫虫蜕为底物，测定菌株产生的几丁质酶对黄粉虫虫蜕的降解效果。利用几丁质酶直接降解黄粉虫虫蜕，制备几丁质降解产物，才能真正地实现黄粉虫虫蜕废弃物的资源化利用。有研究表明，几丁质的降解产物如几丁寡糖可以抑制植物病原菌[28]。因此，可以尝试将该菌株产生的几丁质酶和黄粉虫虫蜕共同施入大田，研究生防菌剂来达到生物防治植物病害的目的。

本试验从填埋黄粉虫虫蜕的土壤中筛选到1 株类芽孢杆菌Wn，在以8 g/L 的胶体几丁质为唯一碳源、装液量达1/3（50 mL/150 mL）、pH 值7.5、温度为30 ℃的培养基中，培养96 h 时酶活性最大。但该菌株最高酶活性相比其他细菌产酶能力偏弱，仅为0.155 U/mL，推测可能是由于单因素试验不能考虑到菌株培养条件的各因素之间的交互作用，得出的最佳培养条件并不是该菌株的最优培养条件，还需根据Box-Behnken 响应面设计原理继续优化该菌株的培养条件，也可通过基因工程优化菌种以提高产酶能力[29-30]，故几丁质酶的纯化、功能基因的克隆与构建表达载体有待进一步研究。