4类除草剂对土壤酶活性的影响研究进展

杨峰山，高梦颖，孙 丛，王颜波，杨思源，付海燕，刘春光

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500；2黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，哈尔滨150080；3黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，哈尔滨150080）

0 引言

除草是农作物生产的重要组成部分，通常是通过体力劳动来完成的，但由于除草作业费工费力，在当今劳动力短缺和劳动力成本增加的情况下，这种情况越来越不常见，化学除草具有简单方便、节省人力、除草效果好等优点[1]。因此，化学除草剂已经成为现代农业不可缺少的重要组成部分。但不可否认的是，化学除草剂在给人们带来巨大的经济效益和社会效益的同时，其广泛应用也给人们带来了一些负面影响[2]。一些研究表明，喷洒的除草剂作用在杂草上不到1%，99%以上的除草剂散播到周围环境中，随着施用面积的扩大，农田系统中残留的除草剂可能对作物、土壤和水体造成污染。化学除草剂在世界范围内广泛使用，常用的除草剂有400多种。2007年，世界农药支出总额约为394亿美元，除草剂约占销售额的40%，占最大份额，其次是杀虫剂、杀菌剂[3]。除草剂在促进作物产量方面发挥着关键作用，也造成了严重的环境污染问题，在某些条件下，某些除草剂可以通过淋洗或地表径流来运输，污染地下水或遥远的地表水源。一些除草剂会导致一系列的健康影响，从皮疹到死亡[4]。除对生态系统造成污染的风险和对人体健康的风险外，以往作物上使用的除草剂残留还会对轮作作物造成植物毒性，威胁食品生产安全[5]。

由于除草剂的毒性和在环境中长期存在，人们对其在生态系统中的残留相当关注。微生物分解代谢是除草剂在环境中消散的主要途径。从20世纪中叶开始，已经分离出数百种能够降解各种除草剂的微生物。在这些微生物资源的基础上，阐明了许多微生物的除草剂代谢途径，鉴定了几十个与除草剂分解代谢有关的基因和酶，并报道了微生物对除草剂污染部位的生物修复。土壤酶主要由生长在动植物残渣上的微生物产生，是土壤生态系统中负责生化过程的最活跃成分之一[6]。由于土壤酶活性对环境变化敏感，土壤酶对自然或人为因素引起的土壤变化能够迅速作出反应，并反映了土壤的化学和物理条件以及代谢状态[7-8]，因此在许多实验室和田间试验研究中，它们被用作土壤污染的质量指标，该指标可用于指示土壤微生物活性、土壤质量和土壤生产力[9-11]。酶催化土壤中的生物地球化学过程，如脲酶和磷酸酶分别参与氮磷循环，脱氢酶可以反映土壤微生物的代谢活性微生物活性，易受有毒有机物的影响，研究表明，土壤中残留的除草剂可影响酶活性和土壤微生物群落[12-16]。土壤酶活性也是土壤微生物群落对代谢需求的直接表达，发挥着物质循环、能量转换和污染物降解等多种功能，从而促进了农业系统的可持续利用和环境质量[17-18]。土壤酶活性、土壤微生物群落的丰度、多样性和结构以及土壤功能基因的丰度对环境变化的响应迅速，因此，它们被广泛应用于研究土壤对环境污染物的响应，尽管在除草剂的作用下土壤中的酶活性是一个重要的问题，但在研究中却被忽略了，到目前为止，针对该问题的工作很少，本研究通过总结和梳理施用四类除草剂的危害和对土壤酶活性的影响，以期为除草剂污染的土壤修复提供理论依据和参考。

1 氯乙酰苯胺类除草剂对土壤酶活性的影响

1.1 氯乙酰苯胺类除草剂的概述

氯乙酰苯胺类除草剂常用于玉米、棉花、玉米、水稻、大豆、甘蔗、甜菜根、向日葵等作物。这些除草剂的水溶性相对较高，在自然界具有持久性，因此，它们的残余物及其代谢物通常在土壤以及地表和地下水中被检测出来[19]。最常用的氯乙酰苯胺类除草剂是乙草胺、丙胺、丁草胺、异丙甲草胺、s-异丙甲草胺、前甲草胺和丙草胺，这些除草剂被美国环保局列为B2、L2和C类致癌物，据报道有中度到高慢性毒性[20]。生态毒理学研究表明，这些除草剂是导致大鼠、鱼类和人类细胞DNA损伤和肿瘤诱导的诱因，这是在体外研究死亡期间发现的[21]。因此，人们对这些除草剂在环境中的去向和清除给予了很大的关注。

1.2 氯乙酰苯胺类除草剂对土壤酶活性影响

土壤微生物产生的许多酶可参与土壤碳、磷、氮循环植物、土壤和微生物之间的相互作用，对土壤生态系统功能至关重要[22]。土壤人为污染物可以通过直接调节或通过对微生物群落的影响来限制酶促养分矿化，从而影响农业和非农业土壤中的植物生长。磷酸酶活性是细胞代谢过程中必需的养分磷循环所必需的，在这里被用作土壤酶功能的代表。

单敏等[23]通过从浙江大学华家池校区大棚蔬菜地试验田采样研究施用丁草胺对土壤酶活的影响，研究结果表明不同浓度(2、4、10 mg/kg)的丁草胺对土壤酸性、碱性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶均有一定的抑制作用，且随着浓度的增加而增加，随着时间的延长，抑制作用缓慢消失，酶活性恢复到与对照水平一致。丁草胺过氧化氢酶表现出一定的促进作用。

严岩等[24]通过田间模拟试验，研究了施用丁草胺对松嫩平原西部灌区盐碱芦苇湿地土壤酶活性的影响，结果表明不同浓度(360、720、1440 μg/L)的丁草胺加入盐碱芦苇湿地1个月内迅速下降，不同浓度丁草胺对湿地土壤酶活性的影响不同，中高浓度丁草胺对土壤过氧化氢酶活性有显著抑制作用，但对碱性磷酸酶活性无显著影响；中浓度丁草胺对土壤蔗糖酶活性有显著影响。

丁草胺对土壤酶活性的影响结果不同，可能是由于研究环境的不同所形成的微生物种群不一样和微生物数量上的差异所造成的，还可能是因为研究的丁草胺浓度不同和时间不同对酶活性以及微生物种群的影响不一样所导致的。

2 苯氧乙酸类对土壤酶活性的影响

2.1 苯氧乙酸类除草剂的概述

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和2-甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)是一类合成植物生长素，广泛应用于多种作物中。这些化合物是世界上使用最广泛的除草剂之一。它们在土壤中高度流动，MCPA通常比2,4-D更持久，2,4-D可能对哺乳动物造成中度急性毒性，2,4-D也可能对水生无脊椎动物、浮游植物和鱼类有毒，尽管不同物种的毒性和损害程度不同[25]。二氯喹啉酸（3,7-二氯-8-喹啉-羧基）是一种高选择性生长素除草剂，广泛应用于稻田稗草和某些双子叶杂草的防治，二氯喹啉酸是高度稳定的，降解非常缓慢[26]。二氯喹啉酸残留对许多作物和蔬菜具有植物毒性，已成为稻-多巴轮作的主要问题之一。在稻烟轮作田，二氯喹啉酸残留会对烟草造成严重的植物毒性。二氯喹啉酸的残留也可能影响微生物的活性，并通过土壤污染对环境造成潜在危害。

2.2 苯氧乙酸类除草剂对土壤酶活性的影响

土壤酶活性被认为是对污染敏感的，并被提议作为土壤退化的指标。过氧化氢酶（过氧化氢氧化还原酶，酶代码EC1.11.1.6）是一种细胞内酶，存在于所有需氧菌和大多数兼性厌氧菌中，但在专性厌氧菌中不存在[27]。众所周知，氧还原的产物，如过氧化氢、超氧自由基、羟基自由基等，对细胞具有很强的毒性，并可能破坏细胞大分子。过氧化氢酶能将过氧化氢分解成分子氧和水，从而防止活性氧对细胞的损伤,这种酶存在于所有需氧微生物、植物和动物细胞中。虽然它是最早分离纯化的酶之一，但其生理功能和调节机制仍不清楚。过氧化氢酶活性可能与需氧生物的代谢活性有关，并被用作土壤肥力的指标。过氧化氢酶活性在土壤中是非常稳定的，并且显示出与有机碳含量随着土壤深度的降低而显著相关[28]。

和文祥等[29]通过从西北农业大学试验田采集土样，利用模拟法研究施用2,4-D对土壤酶活性的影响，结果表明2,4-D能显著降低土壤脲酶活性，土壤脲酶活性先是有一个缓慢的浓度周期，变化不大，然后表现出较强的抑制作用。土壤转化酶效应无规律性变化，对2,4-D的响应相对较慢。随着农药浓度的变化，土壤碱性磷酸酶活性先被激活，再被抑制，最后被激活，说明磷酸酶活性与土壤污染密切相关；杨彩宏等[30]通过广东省白云水稻试验田采集土样研究施用二氯喹啉酸在在淹水和不淹水的条件下对土壤酶活性的影响，研究结果表明不同浓度(0、83.3、166.6 μg/kg)的二氯喹啉酸在水淹条件下对脲酶的影响不同，表现为高浓度促进，低浓度抑制；在不淹水条件下，则低浓度促进；在水淹和不淹水条件下，土壤中过氧化氢酶活性是一致的，都是伴随二氯喹啉酸浓度的增大而升高；在淹水土壤中，纤维素酶活性会随着二氯喹啉酸浓度的升高而下降，在相同浓度的非淹水土壤中，纤维素酶活性会随着处理时间的延长而下降；在淹水土壤中脱氢酶活性变化趋势与对照组一致，表现为二氯喹啉酸浓度越高，脱氢酶活性越低。

3 二苯醚类除草剂对土壤酶活性的影响

3.1 二苯醚类除草剂的概述

二苯醚类除草剂目前是世界上最大的一类除草剂，1901年首次报道[31]。中国二苯醚类除草剂主要有9大类[32]：氟草醚、氟草醚、乳香醚、双酚醚、氟草醚、氟乙草醚、氯草醚、氯草醚和乙草醚。目前，乳粉、氟磺胺草醚、氟氧芬因其高效、低毒、高选择性而得到广泛应用。二苯醚类除草剂是一类广谱除草剂，使用寿命长。氟草醚、氟磺胺草醚、氟乙草醚等除草剂具有高活性和高选择性，对一些敏感作物有一定的危害。研究表明，土壤中的二苯醚类除草剂可以通过光解、化学水解和微生物降解等途径降解，微生物降解是主要途径[33]。

二苯醚类除草剂氟磺胺草醚｛5-[2-氯-4（三氟甲基）苯氧基]-N-[甲基磺酰基]-2-硝基苯甲酰胺｝广泛应用于大豆和一些其他豆类植物阔叶杂草的选择性紧急后防治[34]。氟磺胺草醚自引进中国以来，因其低用量、高除草活性而迅速成为大豆和花生田最受欢迎的除草剂之一。氟磺胺草醚的半衰期从100～240天不等，因此人们担心，如果连续几年种植敏感作物，残留的除草剂可能会造成植物毒性和伤害。这种除草剂的持续使用也可能导致食物污染，从而威胁人类健康，残留除草剂也可能通过改变微生物代谢活性、群落结构和酶活性对土壤健康和生物过程产生不利影响[35]。

3.2 二苯醚类除草剂对土壤酶活性的影响

土壤酶活性可作为评价除草剂对土壤生态效应影响的指标之一[36]。转化酶是土壤中普遍存在的酶，对于从蔗糖中释放果糖和葡萄糖很重要，因此为土壤微生物的生长提供了易于降解的碳源，因此其抑制作用是碳循环和微生物生长普遍关注的问题[37]；脲酶是催化尿素水解为CO2和NH3的酶，是土壤氮素循环的关键组成部分，脲酶活性存在于大量的土壤细菌和真菌中，磷酸酶是一种由许多土壤微生物产生的细胞外酶，负责将有机磷化合物水解为无机磷，一些研究人员已经证明，在各种除草剂应用后，脲酶活性要么不变，要么增加，要么减少[38-40]。

郑景瑶等[41]研究发现，氟磺胺草醚可抑制土壤脲酶、蛋白酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性；张清明等[42]通过山东农业大学试验田研究氟磺胺草醚(0、10、100、500 μg/kg)对土壤酶活性的影响，研究表明氟磺胺草醚对酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脱氢酶活性有不同的刺激作用，其中脱氢酶对氟磺胺草醚最敏感。在第10天，不同浓度的氟磺胺草醚对脲酶活性有明显的抑制作用，30天后这种抑制作用逐渐消失并恢复到对照水平；胡海燕等[43]研究表明高剂量(37.5 mg/ kg )和低剂量(18.75 mg/ kg )的氟磺胺草醚分别从第30天和第45天到试验结束（90天）显著降低根际土壤中的脲酶和转化酶活性；郑丽英等[44]通过湖南省常德取样模拟试验研究双草醚对土壤酶活性的影响，结果表明，双草醚对土壤过氧化氢酶活性略有抑制，21天后恢复正常，双草醚可抑制脲酶活性，浓度越低抑制效果越明显。

4 二硝基苯胺类除草剂对土壤酶活性的影响

4.1 二硝基苯胺类类除草剂的概述

二硝基苯胺类除草剂是一类高效的除草剂，广泛应用于防治棉花、大豆、玉米等作物的多种一年生禾草和某些一年生阔叶杂草[45-46]。最常用的二硝基苯胺类除草剂包括二甲戊灵、丁胺灵、氟乐灵和稻瘟灵。二甲戊灵是仅次于草甘膦和百草枯的第三大除草剂，也是世界上使用最广泛的选择性除草剂。二硝基苯胺类除草剂在土壤中中度持久，半衰期约为3～12个月。二硝基苯胺类除草剂的广泛使用和长期存在，导致其在土壤、地下水和地表水中的频繁检测，这些除草剂对环境造成了负面影响[47]。二硝基苯胺类除草剂对水生生物和大鼠具有较高的毒性[48-49]。二甲戊灵是一种可能的人类致癌物质，美国环境保护署(EPA)将其归类为一种持久性生物累积性毒素[50]。此外，氟乐灵被怀疑是内分泌干扰物，并被归类为C组可能的人类致癌物[51-52]。二甲戊灵主要通过硝基还原和氧化脱烷基途径代谢[53]。

4.2 二硝基苯胺类除草剂对土壤酶活性的影响

除草剂在土壤中的降解受多种因素的影响，包括土壤类型，pH值和有机质含量。除了土壤之间的物理和化学差异外，土壤微生物群落的差异还可以极大地影响降解的速度和程度。土壤和微生物群落的差异可能是导致研究之间存在差异的原因。

王维静等[54]通过沈阳农业大学试验田研究氟乐灵对土壤酶活性的影响，结果表明氟乐灵能刺激土壤过氧化物酶活性；抑制土壤蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性，氟乐灵浓度越高，效果越明显，一段时间后，抑制酶的活性恢复到对照水平，可见，氟乐灵能在在短期内降低土壤微生物量和酶活性，破坏土壤肥力；范君华等[55]研究结果表明施用氟乐灵后土壤蔗糖酶和脲酶的变化趋势为抑制—促进—抑制—恢复，过氧化氢酶酶活性变化趋势为抑制—促进—恢复，由此可见，氟乐灵的应用过程会对环境产生一定的影响，在试验剂量和时间范围内，短期内土壤环境受氟污染的影响较强，随后逐渐减弱和恢复，但对作物生长发育会带来不可恢复的影响。因此，在实际应用中，应按科学用量使用氟乐灵，避免土壤生态环境恶化对作物生长发育的不利影响；胡佳月等[56]通过新疆棉田试验研究施用二甲戊灵对土壤酶活性的影响，研究结果表明，不同浓度的二甲戊灵(0、2700、4050、5400 g/hm2)对土壤碱性磷酸酶活性有明显抑制作用；脲酶活性持续被激活，蔗糖酶和脱氢酶活性随二甲戊灵浓度的增加而增加，土壤表层的增强作用明显强于10～20 cm土层，过氧化氢酶在0～10 cm土层的增强作用最为明显，随着处理时间的延长，二甲戊灵先抑制后激活，二甲戊灵能激活脲酶和过氧化氢酶，抑制碱性磷酸酶，降低棉田土壤有效磷含量，长期施用二甲戊灵可引起土壤养分失衡。

5 总结与展望

由于在现代农业中，除草剂的广泛使用是世界范围内的普遍做法，因此除草剂对土壤的污染可能会增加[57]。高浓度的除草剂活性物质经常残留在土壤中，经常会发生生物和物理化学变化，影响土壤中的微生物生长和酶活性。土壤微生物量和酶活性是土壤质量和健康的重要指标，因为它们对土壤的自然或人为变化有直接的反应。土壤环境中微生物分布是决定作物发育和生产力最佳条件的关键因素[58-59]。

除了对微生物的影响外，除草剂的积累还对土壤酶产生显著影响，而土壤酶是影响微生物在土壤中栖息地的重要催化剂[60]。土壤中存在的酶可能有多种来源和来源，其中之一是腐烂的原核或真核细胞。此外，土壤酶是真菌和植物根系分泌到土壤中的独立细胞外蛋白[61]。由于除草剂的结构多样性和分解途径的多样性，很难解释施用农药后的酶和微生物反应。还应提及的是，在自然环境中，除草剂的微生物降解是由多种物质的混合物组成的，而实验室试验往往分析单一活性物质的分布。这样的试验可以确定农药中单个活性物质的降解途径。然而，在其他理化土壤因素的影响下，活性物质混合物在土壤中的分布却鲜有研究，土壤基质是一种复杂而困难的研究材料，因为它具有各种重叠的环境参数，例如：温度、pH值、颗粒组成、氧化还原电位、金属离子和其他离子的存在，在某些情况下还包括各种有机物（腐殖酸、农药、有机物、无机物、，多环芳烃、多氯联苯-多氯联苯等），所有这些因素都影响微生物和土壤酶的活性[62]。

利用基因工程的方法和各种生物技术，可以分析除草剂是如何被微生物生物降解的，基因工程产生的新菌株能够更有效地降解各种化合物的复杂混合物，特别是除草剂等环境污染物。另一个问题与生物活性测定方法的选择有关：现有的方法很多，而且差异很大。在某些情况下，很难为特定的微生物活性选择合适的试验。这种状况的条件是缺乏所有实验室接受的标准分析方法，而这些方法是解释结果所必需的。此外，在样品收集、储存、预处理以及测定酶和微生物活性的方案方面也存在差异，所有这些因素都影响着酶编码基因的比较和土壤中酶的活性。对于这一课题的研究仍然非常重要，因为这些研究可以深入了解土壤中酶的来源，确定各种污染物对土壤健康的影响。