高效液相色谱法测定磷酸吡哆醛中维生素B6及其有关物质

2021-04-18陈奀飞沈大冬韩忠耀

理化检验-化学分册 2021年4期

陈健 ,陈奀飞 ,王莉 ,盛力 ,沈大冬 ,韩忠耀

(1.浙江医药股份有限公司研究院,绍兴 312500;2.黔南民族医学高等专科学校,都匀 558000)

磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6(VB6)的主要辅酶活性形式,参与多种氨基酸代谢转化[1-2],其结构式见图1。其中,涉及氨基酸多种反应,在代谢转换、物质合成中发挥着极为重要的作用[3]。PLP 既可以作为药物用于临床,促进转氨作用提高体内多巴胺的含量[4],进而用于治疗帕金森综合征[5];也可以作为其他原料药的起始物料,用于合成β-羰基酰胺类药物等研究[6]。

图1 PLP的结构式Fig.1 Structural formula of PLP

PLP一般以VB6为原料合成[7-8],因此,在PLP质量研究中,VB6(已知杂质)和其有关物质(未知杂质)的含量测定具有十分重要的意义。长久以来,起始物料的质量控制在原料药注册技术要求中一直有着举足轻重的地位,人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)及各国药审监督机构相继出台相关技术要求予以规范。目前,对于PLP 的研究,主要以合成工艺改进、生物代谢转化[9-10]及临床治疗[11-12]居多,对于其质量控制的相关研究鲜有报道。

本工作应用高效液相色谱法(HPLC)建立了PLP中VB6及其有关物质含量测定的方法,为PLP质量标准的建立,提供更为科学的试验依据和方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配紫外检测器(VWD)、二极管阵列检测器(DAD)和Agilent Open Lab CDS2.3色谱工作站;XS205型分析天平;S220型pH 计。

磷酸二氢钾-1-庚烷磺酸钠缓冲溶液:称取0.85 g磷酸二氢钾和3.0 g 1-庚烷磺酸钠,溶于1 L水中,并用三氟乙酸调节溶液pH 至3.0。

稀释剂:称取磷酸氢二钾4.33 g溶于1 L水中,作为试验中配制溶液的稀释剂备用。

PLP对照品储备溶液:2.50 g·L-1,称取PLP对照品50.0 mg于20 mL容量瓶中,用稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀。

VB6对照品储备溶液:62.5 mg·L-1,称取VB6对照品12.50 mg于200 mL 容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。

PLP对照品溶液:5.00 mg·L-1,称取PLP 对照品12.50 mg于25 mL 容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。移取该溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。

VB6对照品溶液:2.52 mg·L-1,称取VB6对照品6.30 mg于25 mL容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。移取该溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。

PLP供试品溶液:0.5 g·L-1,称取PLP 供试品约25 mg于50 mL容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。

PLP 对照品(批号:100855-200701,纯度为99.3%),VB6对照品(批号:100116-201705,纯度为100.0%);PLP供试品(来自3家公司,批号分别为170803H、20191015、AR1930N01);磷酸二氢钾(纯度为99%),磷酸氢二钾(ACS 级),1-庚烷磺酸钠(纯度为99.5%),三氟乙酸(纯度为99.9%),乙腈(纯度不小于99.9%);试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Diamonsil Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);检测波长294 nm;流量0.9 mL·min-1;柱温47 ℃;进样量5μL;流动相:A 为磷酸二氢钾-1-庚烷磺酸钠缓冲溶液,B为乙腈。梯度洗脱:初始A为100%,保持13 min;13～25 min时,A 由100%降至80%,保持10 min。

1.3 试验方法

移取一定量的待测液(对照品溶液或供试品溶液),按色谱条件进样测定,记录目标物峰面积。采用外标法定量,以峰面积计算VB6含量,其他未知杂质使用主成分对照法计算。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

分别移取PLP 对照品储备溶液2 mL 和VB6对照品储备溶液0.4 mL,置于同一个10 mL容量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀。于色谱条件下进样测定,所得色谱图见图2。

图2 PLP和VB6对照品混合溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of the mixture solution of PLP and VB6reference

由图2可见:PLP 和VB6可以完全分离,相互之间无干扰,方法具有良好的专属性。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相、流量和柱温

根据查阅文献可知,可使用HPLC测定VB6的含量[13-15]。由于PLP 是一种非常重要的维生素B族化合物[16],且为极性较强的两性化合物,因此使其和有关物质均在色谱体系下得以合适的保留,成为方法建立的关键。在方法建立初期,本研究根据PLP的化合物结构以及合成工艺中潜在杂质分析,首先考察了流动相分别为烷基磺酸盐和四烷基铵盐离子对试剂时对各组分分离的影响。结果显示:VB6在四烷基铵盐为流动相的色谱体系下,难以保留。因此,试验选用烷基磺酸盐中含碳链较长的庚烷磺酸钠盐(1-庚烷磺酸钠)作为流动相A 相,同时用三氟乙酸和磷酸二氢钾将pH 调节至酸性,使PLP和VB6中的氮原子均带正电荷,与离子对试剂紧密结合,再通过柱温以及流量的优化调整,使PLP中的VB6以及其他杂质,均有良好的保留时间和较好的分离度,优化后的色谱条件见1.2节。

2.2.2 检测波长

PLP和其他杂质最大吸收波长为294 nm,VB6最大吸收波长为292 nm,通常紫外波长检测允许误差范围为±2 nm,因此,结合PLP、VB6和其他杂质的紫外吸收情况(图3)及流动相噪声背景等,试验选择检测波长为294 nm,经方法验证,在该波长下检测方法具有良好的稳健性。

图3 PLP和VB6紫外吸收全波长光谱图Fig.3 UV absorption full wavelength spectrograms of PLP and VB6

2.3 标准曲线和检出限

配制PLP和VB6对照品溶液系列,按色谱条件进样测定。以PLP 和VB6的峰面积为纵坐标,两者的质量浓度为横坐标绘制标准曲线,所得线性回归方程和相关系数见表1。

以3倍信噪比(S/N)计算PLP 和VB6检出限(3S/N);以10倍信噪比计算PLP和VB6测定下限(10S/N),结果见表1。

表1 PLP和VB6的线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits,and lower limits of determination of PLP and VB6

2.4 方法的精密度

称取PLP供试品25 mg于50 mL 容量瓶中,向其中加入VB6对照品储备溶液2 mL,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,平行配制6份,按色谱条件进样测定。结果显示:6份供试品溶液中VB6的平均质量分数为0.48%,相对标准偏差(RSD)为0.92%;其他未知杂质和总杂质平均质量分数分别为0.39%,1.71%,RSD 分别为2.8%,1.5%。

另一分析员,在不同日期使用不同仪器,重复平行配制上述溶液6份,按色谱条件进行测定。结果显示:6份溶液中VB6的平均质量分数为0.54%,RSD 为0.89%;其他未知杂质和总杂质平均质量分数分别为0.47%,1.82%,RSD 分别为2.5%,1.3%。表明在该色谱体系下,测定PLP 中的VB6含量及其有关物质具有较好的重复性。

2.5 回收试验

称取9份PLP供试品25 mg于50 mL容量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,作为空白VB6供试品溶液。按照ICH Q2B[17]中范围的要求,每3份空白供试品溶液作为一组,3组供试品分别在高、中、低3个水平的加标量下加入VB6对照品,按色谱工作条件进样测定,每份重复测定5次,计算VB6的回收率和测定值的RSD,结果见表2。

由表2可知:VB6的回收率为99.5%～102%,该方法可准确定量PLP中VB6的含量。

2.6 方法的稳健性

固定其他色谱条件,分别改变色谱条件中的流量和柱温两个条件,以考察方法的稳健性。称取PLP供试品25 mg于50 mL容量瓶中,向其中加入VB6对照品储备溶液2 mL,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,平行配制6份,考察流量为0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1,柱温为46 ℃和48 ℃时,供试品中各组分质量分数的变化情况,结果见表3。