实时荧光定量RT-PCR 在麻疹病毒检测中的应用价值

王 颖，赵志武

（天津市蓟州区疾病预防控制中心检验科，天津 301900）

麻疹（measles）是一种由于麻疹病毒导致的急性呼吸道感染病，患者临床症状主要表现为发热、皮疹、咳嗽、结膜炎等[1]。近年来，随着生活节奏的加快以及饮食习惯的改变，麻疹的发病率逐年上升，且传染性较强，因此有效地预防措施至关重要。麻疹与急疹、药疹、风疹等具有一定的相似性，临床鉴别诊断的难度较大，如何选择有效地诊断方式，是目前临床面临的重要课题之一[2]。目前临床中检测麻疹病毒的常用方法包括酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、实时荧光定量RT-PCR 等，前者是传统临床诊断麻疹病毒的方法，而实时荧光定量RT-PCR 则是近年来出现的一种核酸检测技术，不仅检测速度较快，且具有高敏感度、高灵敏度的特性[3]。本研究对比了ELISA 法与实时荧光定量RT-PCR 法在麻疹病毒检测中的应用效果，旨在分析实时荧光定量RT-PCR 在麻疹病毒检测中的应用价值，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年12 月～2020 年12 月天津市蓟州区疾病预防控制中心收治的65例疑似麻疹患者作为研究对象，其中男性38例，女性27例，年龄1～13 岁，平均年龄（7.28±1.36）岁。患者临床症状均表现为不同程度的发热、咳嗽、结膜炎等。

1.2 方法 所有患者均在出疹后7 d 内抽取血液样本、采集咽拭子标本进行检测。抽取患者静脉血2～3 ml，在4 ℃环境下离心处理，以2000 r/min 的速率持续离心10 min。离心结束后收集上层血液，在2℃～8 ℃环境下保存待测。

1.2.1 ELISA 法检测 根据麻疹病毒IgM 抗体检测试剂盒（珠海经济特区海泰生物制药有限公司，产品注册号：国食药监械＜准＞字2014 第3401262 号）的说明书进行操作，结束后空白调零，通过酶标仪（美国Bio-Tek 公司）得出450 nm 处吸光度值，或通过A450-630 nm 计算吸光度值，分析检测结果。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR 检测 在患者出疹第5天采集咽拭子样本，通过无菌棉签蘸取咽部分泌物，蘸取时应避开口腔黏膜、舌等部位。置入添加3～5 ml病毒标本保存于液内，在标本袋顶端折断棉签。之后提取RNA，进行后续扩增。采用RT-PCR 法进行检测，严格按照试剂盒（江苏硕世生物科技有限公司）说明书进行操作，合理配置反应体系，在PCR 仪（美国ABI 公司）中进行扩增实验。反应条件如下：逆转录温度控制在50 ℃，时间为15 min，循环1 次；预变性温度控制在95 ℃，时间为15 min，循环1 次；退火、变性、延伸温度控制在94 ℃，时间为15 s，循环40 次。当温度达到55 ℃时，收集所有荧光信号。

1.3 观察指标 比较两种方法检测阳性率及不同采样时间阳性检出率。

1.4 统计学方法 通过SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测阳性率比较 实时荧光定量RTPCR 检测阳性率为29.23%（19/65），高于ELISA 法检测阳性率的10.77%（7/65），差异有统计学意义（χ2=6.923，P=0.009）。

2.2 不同检测时间两种方法阳性率比较 第1 天，ELISA 法检测阳性率低于实时荧光定量RT-PCR法，差异有统计学意义（P＜0.05）；第5 天，ELISA 法检测阳性率高于实时荧光定量RT-PCR 法，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余时间段两种方法检测阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 不同检测时间两种方法阳性率比较[n（%）]

3 讨论

麻疹是国际范围内较常见的疾病类型，患者得病后会有发热、出疹等症状。该疾病多发生于2 岁以下的患者，发病率约为40%～50%，其次为20～39 岁的患者，发病率为25%～35%[4]。近年来，疫苗在临床得到了广泛的应用，但同时随着病毒毒性变化以及成年麻疹病毒感染的发生率的上升，导致麻疹患者受到病毒感染后无明显症状，不仅延长了诊断时间，也难以有效与风疹等类似疾病鉴别，大大提高了临床诊断的难度[5]。麻疹在发病的前后5 d，具有较高的传染性，易感患者与感染源接触后，发病率极高[6]。因此，临床一旦发现疑似麻疹患者，应给与高度重视，及时进行相关临床检测，提高检出率，保证诊断的及时性与准确性，从而避免麻疹的广泛传播[7]。

传统临床对麻疹患者进行相关检测时，会提取患者的血液样本或鼻咽部分泌物。当麻疹患者出现皮疹时的第1 天即可检测出麻疹病毒，因此临床检测对于早期麻疹的鉴别诊断中具有重要的作用。临床检测麻疹病毒的方式较多，其中ELISA 法和实时荧光定量RT-PCR 法是目前最常见的类型，和其他方法相比，这两种方法的操作较为简单，且可实现短时间内检测，灵敏度高[8]。多项研究显示[9-11]，实时荧光定量RT-PCR 相比ELISA 法对麻疹病毒的检出率更高，可能是由于当患者受到麻疹病毒感染后，特异性IgM 抗体反应需要一定的时间，随着采血时间的改变，诊断的结果也会发生一定的变化。若采血时间过早，可能导致检测结果出现假阴性，若采血时间过迟，不仅会增加采血的难度，还可能错过最佳的治疗窗口时间，影响临床疗效，对患者的早期诊断与治疗造成了严重的影响。由此可以看出，ELISA 法在临床麻疹病毒的检测中存在明显的缺陷。本次研究结果显示，实时荧光定量RT-PCR 检测阳性率明显高于ELISA 法，差异有统计学意义（P＜0.05）。65例疑似麻疹患者均在出疹7 天内采集样本，ELISA 法出疹第1 天检测阳性率为14.29%；，实时荧光定量RT-PCR 出疹第1 天检测阳性率为73.68%，差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISA 法出疹第5 天阳性率为28.57%，实时荧光定量RT-PCR 法出疹第5 d 阳性率为0，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，不同的采血时间其检出率也有所不同。在出疹后的1～3 d，ELISA 法检出率较高，当出疹时间延长至4～7 d 时，ELISA 法检出率有明显的下降趋势。因此，临床对于疑似麻疹患者，应在出疹后立即采集样本，并通过ELISA 法检测血清样本IgM 体，若病毒检测显示特异性为阴性，则应在出疹后4～28 d 内再次检测，从而有效控制疾病的传播。实时荧光定量RTPCR 在麻疹病毒检测方面具有明显的优势，阳性率高于ELISA 法，且能够在出疹后1 d 检测出麻疹病毒，对早期诊断、治疗具有重要的参考价值，还有利于控制疾病的传播。

根据荧光定量RT-PCR 计数的特点，检测方法可分为绝对定量和相对定量两种。绝对定量指的是通过对已知标准品进行稀释，根据稀释后的标准品建立标准曲线，曲线中ct 值与初始RNA 或eDNA 拷贝数有线性关系，医务人员可以根据这种关系，通过分析CT 值明确未知样品起始模板拷贝数[12]。使用这种方法时，首先需要架设标准品与未知样品的扩增效率相等，在稀释标准品时，要保证处于可测量的范围内。对于标准品的选择较为多样化，既可以是双链DNA，也可以是单链DNA 或承载靶序列的eRNA[13]。该测量方法主要用于体液中病毒或肿瘤负荷的定量。绝对定量法的检测准确度与标准品的准确度密切相关。但这种方法也存在一定的缺陷，即检测时样品中可能存在抑制剂，可能会影响结果的准确性[14]。相对定量指的是在测量目的基因的同时，测量另一内源性管家基因，先对目的RNA 的ct 值与管家基因ct 值进行对比，根据结果设置目的RNA 的值，实现各个样品之间的互相对比，能够分析出不同样品RNA 的相对表达量[15]和绝对定量相比，相对定量法的关键在于保证RNA 与内源性管家基因的扩增效率相同，否则也会对检测结果的准确性造成影响[16]。

在荧光定量RT-PCR 技术中，每个环节都至关重要，一旦出现人为失误，就会对检测的结果造成影响[17，18]。目前医学界认为Oligo（dT）是合成cDNA 的最佳选择，特异性明显高于其他随机引物。该物质仅会与带有poly A+（多聚腺苷酸）尾巴的mRNA 结合，但是Oligo（dT）对RNA 序列的要求较高，不仅需要高质量，还要保证是全长，因此甲醛固定经石蜡包埋组织中提取的片段RNA 难以进行逆转录[19]。另一方面，在逆转录过程中若出现二级结构或引物探针结合点位处于mRNA 的5 端时可能会造成影响，因此临床使用时可以将Oligo（dT）与随机引物混合使用，从而提高检测的准确率。最好的方法是选择目标特异性引物合成的cDNA 特异，这样能得到较为精确的结果，但由于不同目标的特异性RNA 逆转录需要单独进行，当提取到的RNA 量较少时，会出现浪费的情况[20]；第三，抑制剂影响。RNA 在提取、纯化所经历的各个环节中，都存在着不同的抑制剂，会对mRNA 的定量造成一定的影响，例如体液成分、血红蛋白、尿素等。另一方面，DNA 片段、残余抗凝剂等也会对PCR 的发生效率造成影响，不同的多聚酶对不同抑制剂的敏感性也有所区别，导致PCR 结果存在一定的误差。因此，在选择材料时，应以耐热DNA 多聚酶为主。此外，还有一些其他因素可能影响RT-PCR 的检测结果，如实验室、操作人员、公司试剂等，临床中必须要对这些因素进行全面的质量控制，保证RT-PCR 的检测质量。

综上所述，对麻疹病毒采取实时荧光定量RTPCR 检测，具较高的阳性检出率，降低麻疹漏诊率，操作简单，为麻疹疫情早期控制及处理起到积极的促进意义。