畜禽养殖环境中的空气颗粒物

马振华，张喜庆，刘继军，梁小军，李文才，高云航*

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春130118;2.中国农业大学 动物科学技术学院，北京100193；3.宁夏农林科学院，宁夏 银川750002；4.德惠市畜牧总站，吉林 德惠130300)

畜禽养殖业是我国农业经济发展中的重要支柱产业，更是我国经济体系中不可或缺的一环。近年来，随着在产业链中引进互联网技术与更为科学的饲养管理技术，我国畜禽养殖业呈现出快速发展的态势[1]。相关数据显示，截止到2017年底，我国养牛量9 039万头，养羊量30 232万只，肉猪年出栏量70 202万头，极大地满足了人们生活中对动物制品的需求[2]。与此同时，我国畜禽养殖业也正在面临着巨大的疫病防控压力，自2018年非洲猪瘟在我国首次出现以来，我国养猪业遭受了极大的经济损失，其他动物疫病也呈现散发状态，当前疫情防控形势依然严峻[3]。因此，应把防范疫病的传播排在首要位置。疾病的传播途径有很多种，但在养殖环境中，空气颗粒物这种肉眼不可见的传播介质往往被忽视，其通常携带有病原微生物，给人和动物带来危害，造成不可挽回的经济损失。例如，1981年法国暴发口蹄疫，病毒通过空气传播导致英格兰口蹄疫的暴发[4]；2001年，美国境内出现炭疽感染致多人死亡事件，而空气颗粒物是其主要传播途径[5]；此外，高浓度的空气颗粒物会导致动物肺部损伤以及机体代谢紊乱[6]。

对空气颗粒物进行深入的研究，在多个方面都具有重要意义。一方面，通过研究畜禽养殖环境中空气颗粒物的特征，有助于分析某些疾病的传播机制，找到更为有效的疫病防控措施，对我国畜禽养殖业的健康发展具有深远意义；另一方面，对于保障长期在养殖场环境中的工作人员健康也是至关重要；此外，通过实验室进行动物试验等对环境颗粒物的研究，了解致病机制，为临床医疗领域提供理论依据。因此，对于畜禽养殖环境中空气颗粒物的深入研究是很有必要的。现分析了目前畜禽养殖环境中空气颗粒物的研究动态，概述了几种相关的研究技术与方法，以期为完善畜禽养殖业的疫病防控措施，改善养殖环境提供理论依据。

1 畜禽养殖环境中空气颗粒物的概述

空气颗粒物是成分多样的混合物，其粒径大小一般从几纳米到几十微米不等，能够较长时间的悬浮于空气中[7]。大量研究表明，畜禽舍内具有复杂的微生物结构，空气颗粒物中的微生物水平要远远高于外界环境[8]。因此，现主要论述的是畜禽舍内空气颗粒物本身的生物学特性，以及对环境内生物健康的影响。

当微生物与悬浮在空气中的固态或液态颗粒物相结合，形成相对稳定的胶体分散系时，我们可将其称之为“微生物气溶胶”[9]。不同种类的微生物与空气颗粒物结合也可称之为细菌气溶胶、真菌气溶胶以及病毒气溶胶等。微生物凭借胶体分散系的相对稳定性，以其为介质进行传播，是引发动物患病的重要因素。当空气颗粒物的动力学直径小于2.5 μm时，我们也可以将其称为“PM2.5”。PM2.5的粒径更小，除了会携带致病微生物传播疾病以外，还能深度侵入肺部，对呼吸系统造成一定的损害[10]。因为空气颗粒物具有良好的微生物承载性，以及相对容易侵入呼吸系统，意味着空气颗粒物在疾病传播过程中具有不可忽视的作用。

1.1 畜禽养殖环境中空气颗粒物的来源在养殖场环境中，空气中悬浮颗粒物的来源有多种。较为常见的有以下几种：动物身体表面的皮屑、排出的粪便、污染的饲料与垫料、饲养舍内过道的灰尘、排污口的污水等，都会随着动物与饲养人员的活动过程将其挥散在空气中。黄凯等[11]研究发现，在喂料、清粪时，会引起舍内空气颗粒物浓度升高；沈丹等[12]也发现，鸡舍空气颗粒物主要来源于饲料、粪便和地面扬尘等。在北方的冬季，饲养环境较为封闭，空气流通受限，悬浮在空气中的颗粒物往往存在时间更久、浓度更大，这些粒径较小的颗粒物即使沉降下来也会很容易的又飘散到空气中，更难以清除，因此很容易导致疾病的传播与反复发生[13]。

1.2 畜禽养殖环境中空气颗粒物的危害空气颗粒物所造成的危害更多是取决于附着在颗粒物上的微生物。从空气颗粒物中很容易检测到各种真菌、细菌、芽孢等，在长时间的接触过程中，导致了养殖场动物与工作人员感染疾病，其中如牛结核等人兽共患病对工作人员的健康威胁更为严重。钟召兵等[14]研究发现，鸡舍中每天约有6.1×105CFU的气载细菌可分别进入人和动物的肺部，危害相对较大。PM2.5因其动力学直径较小，能够相对容易的随呼吸进入肺脏深部，引起呼吸系统的疾病。很多研究均证实了PM2.5会导致过敏性鼻炎、呼吸系统免疫损伤、支气管上皮细胞损伤、甚至是癌症的发生。如JEONG等[15]发现PM2.5暴露于呼吸系统后，小鼠的肺和肝脏中出现了明显的炎症信号转导。长期存在于养殖环境中的空气颗粒物应得到管理人员的重视，需采取科学的方法，如定期对畜禽舍进行合理的通风、消毒等措施，以消除或削弱这种对健康的威胁[16]。

1.3 国内外研究现状国外对于环境空气颗粒物的研究相对较早，除了对其理化性质、来源解析、影响因素等方面提供了丰富的研究方法外，在其对动物机体的损伤与致病机制等方面也有较深入的研究。例如，QIN等[17]发现，暴露在高浓度的PM2.5环境中会引起人类咽部的微生物组成发生变化；QIAN等[18]研究了猪舍空气颗粒物诱导肺泡巨噬细胞免疫应答的机制；此外，MONTOYA等[19]研究发现，PM2.5可使巨噬细胞产生肿瘤坏死因子。他们的一些研究思路与方法值得我们去学习参考。

目前，国内对于空气颗粒物的研究较多的是以城市街道、污水处理厂等人类公共场所以及畜禽养殖环境为研究对象，分析其空气颗粒物的无机组成成分、微生物群落结构、内毒素含量等。任艳芹[20]研究发现，典型城市中，总悬浮颗粒物(TSP)中多环芳烃(PAHs)总浓度在冬季比夏季高出5～10倍，煤燃烧、交通排放和生物质燃烧是这些有机物的主要来源；沈美艳等[21]在鸭舍环境中检测到气载需氧菌浓度可达7.24×103CFU/m3，气载金黄色葡萄球菌浓度可达0.56×103CFU/m3，气载真菌浓度可达1.66×103CFU/m3；钟召兵等[22]研究了气相色谱-串联质谱法(GC-MSMS)与鲎试验(LAL)在检测畜禽舍空气内毒素中的应用效果及相关性，结果显示这2种方式均检测到动物舍空气中内毒素浓度超过了对大多数动物和人体有威胁的阈限值1.0×103EU/m3。由于我国在空气颗粒物方面的研究稍晚，许多问题还未进行深入的研究，例如对养殖场空气中抗性基因等问题的研究还相对较少，存在着较大发展空间。

2 研究方法概述

2.1 畜禽养殖环境中空气颗粒物的收集方法对畜禽养殖环境空气中的颗粒物进行收集是试验操作的第一步，因此该操作过程是否合理往往影响着整个试验数据结果的科学性。常见的收集方法一般有以下几种。

2.1.1自然沉降法 原理是空气中的颗粒物在重力的作用下，沉落到无菌的培养皿上，该方法出现时间最早。与其他方法相比，这种收集方法对于微生物的分析是最简便的，也是最为快速的，但因其容易受到环境因素的影响，很难达到量化的水平，只能用于对空气颗粒物进行简单粗略的估测[23]。

2.1.2撞击式采样法 这种方法的原理是通过气泵的抽吸作用，将环境空气通过孔径筛选，并撞击到收集介质上，收集介质常分为固体型与液体型。最为常用的固体撞击式采样器，是将28 L/min的恒定气流量通过各级筛孔撞击到培养基上[24]，这种采样方法的优点是既可以对空气颗粒物进行快速收集，同时还可以对颗粒物进行粒径筛选，方便对采样空气体积进行量化计算；AGI液体撞击式采样器以无菌水或缓冲液为收集介质，以12.5 L/min的恒定气流量通过，但收集效率不及Anderson-6级空气采样器。

2.1.3过滤式采样法 其原理是在环境空气抽吸过滤膜的过程中，颗粒物直接阻留在滤膜上，是收集大气PM2.5的常用方法，TSP大气综合采样器属于这种采样方法。滤膜的材质通常为玻璃纤维、聚碳酸酯、明胶、特氟龙等，在使用前需要在马弗炉中进行灭菌操作。FERGUSON等[25]对这几种滤膜的收集效果进行了评估，结果显示使用玻璃纤维的滤膜收集PM2.5的效果最好。

2.1.4其他方法 如离心式采样法、静电场采样法等，原理是利用离心力、直流电场等作用于空气颗粒物并进行收集。这类采样方法具有采集效率高、收集量大等特点，但也容易受到采集量不稳定，采集范围与采集条件的限制[26]。

2.2 畜禽养殖环境中空气颗粒物成分鉴定分析

2.2.1非生物成分分析 将畜禽养殖环境中空气颗粒物收集后，一般会从颗粒物粒径大小、重金属含量、有机与无机物种类含量等方面对非生物成分进行鉴定分析。采用颗粒物检测仪、高效液相色谱等技术，将分析结果与国家环境标准比对，我们可以初步地判断该环境中对动物与人类有哪些危害[27]。

2.2.2气载微生物鉴定分析 一般需要进行菌群多样性分析、菌群丰度计算、致病菌的分离鉴定等研究；此外对可能产生气载微生物的源头采样，比对分析菌群多样性与菌群丰度，进而追溯微生物来源；通过改变环境条件，分析气载微生物菌群结构变化，以寻找改善动物舍空气质量的方法。例如：许光素等[28]对污水处理厂细菌气溶胶进行了群落结构分析。试验上一般是将收集到的气载微生物经培养基培养与菌落计数；提取DNA与PCR扩增，通过凝胶电泳检测PCR扩增产物后进行高通量测序；根据测序结果确定微生物种类并进行统计学分析。这些研究对减少气溶胶的产生与切断疾病的传播途径具有重要的指导意义，为实际应用中的疫病防控措施提供新的思路。

2.2.3气载耐药菌以及耐药基因鉴定分析 大量研究表明，许多养殖户因促使动物快速生长等目的，滥用抗生素，造成动物制品中药残含量过高、诱导养殖环境中大量的抗生素耐药菌的产生[29]。耐药菌的长期存在，对养殖环境的危害不言而喻。其研究方法一般是对气载细菌进行分离培养与药敏试验、利用荧光定量PCR技术对耐药基因进行定量检测等。柳敦江[30]对鸡舍内的气载金黄色葡萄球菌进行耐药性分析，发现有78.5%的菌株对青霉素产生了不同程度的耐药性。研究空气中耐药菌及耐药基因的存在情况，对兽医临床用药的选择提供方向，防止耐药菌的产生造成不必要的经济损失。

2.2.4气载内毒素的研究与分析 内毒素是革兰阴性菌细胞壁破碎后产生的物质，其主要成分是脂多糖(LPS)，会对动物与人体产生危害，导致机体发热、代谢性酸中毒甚至休克[31]。因此，针对气载内毒素的研究同样具有较大意义。温暖家[32]优化了气载内毒素的采集与检测方法。内毒素检测方法有气相色谱-串联质谱法(GC-MSMS)与鲎试剂检测法(LAL)，其中鲎试剂检测法因其方便快速，价格低廉等特点，成为最为常用的检测方法。

2.3 空气颗粒物致病机制的研究与分析研究表明，空气颗粒物会引起动物的呼吸系统疾病，因此近几年国内外也把视线放在了对空气颗粒物的致病机制的研究上。通过建立动物体内体外PM2.5暴露模型，结合生物学检测技术，探究空气颗粒物对组织与细胞的影响，进而寻找出致病机制。

2.3.1试验动物及体外细胞攻毒 同时在宏观与微观上来了解空气颗粒物对机体的影响，需要在体内攻毒与体外细胞攻毒2个方面着手。动物在畜禽舍环境中，空气颗粒物会直接作用于呼吸系统，因此为模拟真实情况，对于体内攻毒常常选择呼吸系统给药。如LI等[33]将颗粒物先进行超声震荡处理，再利用气溶胶发生器稀释颗粒物，通过自动吸入装置作用于小鼠呼吸道，以此模拟真实环境。丁世彬等[34]将小鼠经乙醚麻醉后，采用气管滴注的方式，将事先处理好的PM2.5悬液滴入小鼠气管，以探究PM2.5对呼吸道的损伤。颗粒物的剂量与浓度需要根据小鼠的呼吸量与体质量合理计算，经过慢性与反复作用后，观察试验动物体征情况，收集动物血液、组织、肺脏灌洗液等，以进行下一步的生化分析[35]。对于体外细胞攻毒试验，需将颗粒物稀释液作用于适宜的细胞系，如肺组织巨噬细胞、支气管上皮细胞等。暴露完成后，收集细胞与上清液，以进一步评估细胞的损伤与凋亡情况、细胞内氧化应激水平与免疫反应情况等[36]。在实际研究中，我们需要根据不同的研究目的来选择合适的攻毒方法，以达到对真实环境更加科学的模拟。

2.3.2组织学与细胞学检测 空气颗粒物对动物机体损伤情况的评估，常用到病理切片技术与HE染色来观察组织增生或损伤情况；对于细胞的损伤情况则选择扫描电镜或共聚焦显微镜来观察。如王凤卓[37]通过对大鼠肺组织切片的观察，发现PM2.5暴露一段时间后，肺间质内可见组织细胞吞噬微量的碳末沉积，肺泡间隔增厚，以及不同程度的炎性细胞浸润等，表明PM2.5对肺泡具有明显的损伤作用。此外，利用ELISA方法检测炎性因子水平，如白介素、INF-γ等，以反映机体的免疫应答情况。张丽凤[38]研究发现，PM2.5致使肺泡灌洗液、血清和肺组织中的炎性因子IL-4、IL-17A及氧化损伤标志物的含量升高，表明小鼠气道在PM2.5的作用下产生了过敏性炎症。还可以利用免疫组化分析巨噬细胞含量、MTT法检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡比例、荧光探针法测定细胞内 ROS 水平等，来进一步详细探究空气颗粒物对细胞的损伤情况。WANG等[39]研究发现，内皮细胞在PM2.5的作用下，试验组与对照组相比，细胞活力明显低于对照组，细胞内ROS水平却明显高于对照组，表明PM2.5能够引起细胞内氧化还原失衡；类似的，周维[40]研究发现，细胞内ROS水平、细胞凋亡比例、DNA损伤水平等都随PM2.5浓度增加而升高，这说明PM2.5不仅会损伤细胞结构，而且对DNA也同样会产生一定的损伤。类如上述指标的测定都在不同方面阐述并验证了空气颗粒物能够在细胞水平上对动物机体产生危害。

2.3.3相关基因与蛋白表达水平检测 空气颗粒物在引起机体损伤的过程中，往往伴随着相关基因与蛋白表达水平的上调与下调。通过同时设置对照组与抑制组的方式，来比较分析差异性表达的基因与蛋白，进而研究空气颗粒物对机体在分子水平上的致病信号机制。对于检测损伤相关的基因与蛋白表达情况主要是qPCR技术与Western blot技术的应用。WANG等[41]在体内和体外试验中发现，PM2.5通过激活Notch1信号途径，诱导了上皮间质转化，同时促进了“癌症干细胞”特性的出现；ZHOU等[42]研究发现，在PM2.5和冷应激的共同作用下，使CD4+T细胞IL-4基因启动子的组蛋白乙酰化水平增加，从而加重了小鼠哮喘；NING等[43]研究发现，小鼠血清中miRNA的异常表达，这可能与PM2.5诱发的肺癌相关通路表达异常相关。在分子水平上的此类研究，说明改善畜禽养殖场环境的空气质量对保障人类与动物健康具有重要意义，除此之外，在人类呼吸道疾病的诊断与治疗上也具有参考价值。

3 展望

空气质量是畜禽养殖环境评测的一项重要指标，因此对空气颗粒物的研究是非常有价值的。从近几年的相关文献来看，未来对畜禽养殖环境空气颗粒物的研究，会由研究空气颗粒物本身及气载微生物组成结构，逐渐向研究其致病机制以及寻找改善养殖环境空气质量的方法过渡。随着国家相关部门对养殖环境的空气质量愈发重视，我国目前在此方面的研究水平上较国外虽有一定差距，但相信这种差距会逐渐缩小，我国畜禽养殖业也会因此受益。