乳酸菌防治奶牛乳房炎的作用效果及前景展望

郑宇慧，薛圣霖，赵岩岩，李胜利

(中国农业大学 动物科学技术学院 动物营养学国家重点实验室， 北京 100193)

乳房炎是奶牛发病率高、流行快、危害大且造成较大经济损失的疾病之一，患病奶牛的产奶量会下降约15%[1]，全球每年因奶牛乳房炎所导致的产奶量下降、废弃奶产生、患病牛治疗和淘汰等造成的经济损失高达350亿美元[2]。根据患病奶牛有无明显临床症状，奶牛乳房炎可分为临床性乳房炎和隐性乳房炎。临床性乳房炎一般能通过肉眼可见的症状来确定，如乳腺发红、发热或肿胀，发病乳区乳汁明显发黄或黏稠等[3]。隐性乳房炎则以乳中的体细胞数增加为特征，无明显的临床症状[4]。细菌、真菌和支原体等都能引起奶牛乳房炎，常见的乳房炎致病菌主要有葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌等[5]。随着人类对动物产品需求的不断增加，动物生产中抗菌药物的使用量预计在2010-2030年将增加67%[6]，因此，畜牧业被认为是导致抗生素残留及细菌耐药性问题产生的重要环节[7]，其中抗生素的使用会直接影响整个食物链[8]。目前，对于奶牛临床性乳房炎的治疗主要依赖于抗生素，而研究发现抗生素虽有较好的抑菌作用，但对后期的炎症控治无明显效果[9]。研究表明，中草药、益生菌和疫苗等[10-12]在替代抗生素方面潜力巨大。其中，乳酸菌具有环境友好，不易导致耐药性病原菌的出现等优势，在替代抗生素防治病原微生物方面研究较多。

1 乳酸菌概述

乳酸菌是兼性厌氧性的革兰阳性菌，可以生长于MRS和血琼脂等培养基，通常为黏液样白色菌落，在血琼脂培养基上表现为溶血[13]。目前，乳酸菌至少可分为18个属，200多个种，主要包括：乳杆菌属(Lactobacilli)、肉食杆菌属(Carnobacterii)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lacococcus)、气球菌属(Aerococcus)、片球菌属(Pediococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)等[14]。

研究表明，许多乳酸菌具有益生作用，在动物机体的免疫和健康方面发挥着重要作用，其益生性主要体现在：调节肠道菌群[15]、缓减肠道疾病[16]、增强机体免疫力[17]、抗氧化[18]、抑制肿瘤[19]、降低胆固醇[20]以及延缓机体衰老[21]等。常见的益生性乳酸菌菌种主要有：嗜酸乳芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等。

2 乳导管注射乳酸菌防治奶牛乳房炎的作用效果

哺乳动物的乳腺一直被认为是无菌器官，但细菌DNA测序结果证明乳腺内存在共生微生物群落，即“共生乳腺微生物群”[22]。这不仅对理解乳房炎的发病机制具有重要意义，还为开发防治乳房炎的新型抗生素替代品提供了思路。有研究发现，通过向奶牛乳导管注射部分乳酸菌菌种，能有效预防或治疗其乳房炎[23-27]。

FIONA等[23]研究发现，给健康荷斯坦奶牛乳导管注射乳酸乳球菌不会引起奶牛炎症反应，且奶牛乳腺中的免疫蛋白在注射乳酸乳球菌后显著表达。KATJA等[24]研究证明，乳导管注射乳酸链球菌与抗生素治疗奶牛乳房炎后，牛乳汁中的体细胞数无显著性差异且治疗后均无明显临床症状，表明乳酸菌在治疗奶牛乳房炎方面具有与抗生素相似的效果。IGNACIO等[25]研究发现给非泌乳期荷斯坦奶牛乳导管注乳酸菌后，其乳汁中的lgG含量和嗜中性粒细胞的吞噬能力显著提高，且试验动物未见任何临床症状。PELLEGRINO等[26]对乳导管注射乳酸菌预防奶牛乳房炎的效果进行了研究，发现乳导管注射乳酸菌可通过调节机体免疫，从而有效预防奶牛乳房炎的发生。MICHAEL等[27]对18头乳房炎奶牛乳导管注射乳酸乳球菌后发现，其对奶牛乳房炎的治愈率达到了47%(商业抗生素为50%)，证明其在治疗奶牛乳房炎方面潜力巨大。还有研究将乳导管注射乳酸菌的方法进行了创新，将其制成新型药浴液进行使用。JIE等[3]对含有2株植物乳杆菌的新型药浴液与商业药浴液的作用效果进行对比，发现用乳酸菌制备的新型药浴液能降低与乳房炎相关细菌的相对丰度，改善奶牛乳头的微生物环境，可用作化学药浴液的替代品。

尽管不少研究证明乳导管注射乳酸菌可以有效防治奶牛乳房炎，但也有研究对此提出质疑，认为乳酸菌自身亦会引发炎症反应，危害动物乳房健康。MIGNACCA等[28]研究表明，乳链球菌虽能短暂地清除母羊乳房内的病原菌，但也引起了中轻度的临床性乳房炎症状。CARLOTTA等[29]研究发现，乳导管注射热灭活的鼠李糖乳杆菌培养物后牛奶中的SCC升高，且假单胞菌的相对丰度上升了4%，而此前的研究证明水牛乳房炎的发生与假单胞菌的相对丰度升高有关[30]，因此提出将其应用于水牛乳房炎的防治仍需研究。

3 乳酸菌防治奶牛乳房炎的潜在机制

3.1 抑制致病菌的定植和黏附乳酸菌可产生多种抑菌物质，如乳酸、短链脂肪酸、过氧化氢、一氧化氮和细菌素等，这些物质帮助其竞争性抑制致病菌的黏附和定植，发挥益生功能[30]。其中，细菌素是细菌产生的具有活性的多肽物质，能通过直接竞争性抑制病原体的入侵或调节微生物群的组成，进而影响宿主的免疫系统。在肠道中，细菌素可以通过多种途径增强乳酸菌的益生功能，如作为定植肽，提高其在宿主微生物群的竞争力；作为杀菌肽，直接清除病原微生物；作为信号肽，向其他细菌或者宿主免疫系统发出信号[31](图1)。因此，基于乳酸菌在肠道中所发挥的益生作用，近年来有不少学者围绕乳酸菌防治乳腺病原微生物展开研究。

图1 细菌素促进乳酸菌益生功能的作用机制[31]

近年来，许多研究者针对乳酸菌对多种乳房炎致病菌的抑菌能力进行研究，得到许多具有高效抑菌能力的优良菌株。许女等[32]研究发现，分离自健康牛乳导管中的乳酸乳球菌CM2能够分泌黏附素黏附于人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)，从而有效抑制大肠杆菌的黏附。CAROLINA等[33]对从健康奶牛乳腺中分离得到的上百株乳酸菌的益生特性进行评价，得出其中9株对乳房炎致病菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌等有明显的抑制作用。WU等[34]研究发现，鼠李糖杆菌GR-1能够有效减少大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞的黏附，减轻大肠杆菌对细胞形态和超微结构的破坏。DAMIEN等[35]以奶牛乳腺上皮细胞为模型，探究了干酪乳杆菌对金黄色葡萄球菌感染的乳房炎的治疗效果，发现干酪乳杆菌对乳腺上皮细胞的内化率低且存活率高，能在不改变细胞活力和形态的情况下，使金黄色葡萄球菌对细胞的内化率降低60%～80%。

以上研究表明，部分乳酸菌菌种能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等奶牛乳房炎致病菌的生长与黏附，这些具有较好抑菌效果的乳酸菌菌株的获得，为乳酸菌防治奶牛乳房炎提供了丰富的选择。此外，从奶牛乳腺中分离的乳酸菌可长期存活于奶牛乳房，更适应奶牛乳房环境，并且这类乳酸菌与奶牛乳房炎致病菌长期存在竞争关系，对奶牛乳房炎致病菌的抑制作用更具有针对性，是筛选防治奶牛乳房炎的乳酸菌菌株的重要方向。

3.2 调节机体免疫功能免疫系统失调是引起机体致病菌感染的重要因素，乳酸菌可以通过调节多个免疫信号通路来发挥其免疫调节作用，抑制致病菌的感染。研究表明，乳酸菌能促进机体免疫球蛋白IgA的分泌和抗菌分子的产生，从而抑制肠道病原菌[36]。此外，乳酸菌还能调节致病菌诱导的机体免疫反应，增加抗炎细胞因子的表达，从而降低坏死性结肠炎等中的炎症反应[37]。近年来，乳腺中的免疫反应一直是许多研究的重点。研究发现，在脂多糖诱发的小鼠乳房炎中，Toll样受体[38]和核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)会被激活[39]，从而刺激小鼠的先天性免疫系统，引发免疫反应。此外，当动物乳腺受到抗原刺激时，乳腺上皮细胞会产生多种趋化因子，这些趋化因子将血液中的白细胞吸引到乳腺组织，进而导致炎症反应的发生。IL-8的分泌受到肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor a，TNF-a)、IL-6和IL-1家族细胞因子等促炎性细胞因子的调控[40]。研究发现，乳酸菌可参与调控上述炎症相关细胞因子的表达，从而降低机体炎症反应。此外，部分乳酸杆菌可显著抑制IL-8的分泌和NF-κB的激活[41]；短乳杆菌1595及1597、干酪乳杆菌1542和植物乳杆菌1610均能显著降低由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和乳房链球菌导致的IL-8的升高[42]；也有研究表明，在大肠杆菌感染的乳房炎中，鼠李糖乳杆菌GR-1能通过抑制NOD样受体识别受体NLRP3及炎性体NLRC4的激活，显著抑制由大肠杆菌引起的IL-1β和IL-18的升高[43]。此外，还有研究发现,乳酸菌能对宿主免疫系统产生刺激且不诱发炎症反应，如在人单核树突状细胞中，鼠李糖乳杆菌能在不引发炎症的情况下刺激TNF-α的适量表达[44];WU等[34]研究发现,用鼠李糖乳杆菌对奶牛乳腺上皮细胞进行预处理能适当刺激TNF-α的适量表达，有效缓减由大肠杆菌所导致的TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-8 mRNA表达的显著上调，缓减炎症反应。

4 乳酸菌防治奶牛乳房炎的前景展望

4.1 乳酸菌对血乳屏障的作用效果及机制奶牛乳腺上皮细胞是组成乳腺的第一层细胞，不仅可以分泌乳汁还能对抗原产生先天性免疫反应[45]。血乳屏障主要由内皮细胞、结缔组织、基膜和上皮细胞构成，相邻的乳腺上皮细胞间的黏附复合物主要包括紧密连接(tight junction，TJ)、黏附连接(adhesion junction，AJ)和桥粒(desmosome)(图2)，这些结构控制着细胞之间的黏附，并将乳汁与血液分隔开，对维持上皮极性和调节屏障通透性起着重要作用。紧密连接是位于血乳屏障最顶端的特殊结构，能够限制水分子、离子和微生物的胞旁流动[46]。动物泌乳期间乳腺物质不能通过紧密连接进行渗透，但奶牛患乳房炎后，病原菌及其内毒素会破坏紧密连接结构，使血液和乳汁中的物质相互渗透[47]。Occludin、ZO-1和Claudins是血乳屏障最重要的紧密连接蛋白[48]，其表达量是体现血乳屏障完整性的重要指标。

图2 乳腺上皮细胞中的细胞-细胞黏附复合物[49]

大量研究证明，乳酸菌在增强肠上皮屏障功能方面发挥着重要作用[50]，类似血乳屏障，紧密连接也是肠上皮细胞间的主要连接方式，其中跨膜电阻值(trans epithellal electric resistance，TEER)是反映上皮屏障完整性的重要指标，值越大屏障越致密完整。体内外大量研究发现乳酸菌能够增强上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-1、Occluding和ZO-1等的表达、提高TEER以维持上皮屏障的完整性[51-55]。RUDOLF等[56]研究发现，乳酸菌、双歧杆菌和链球菌混合而成的组合益生菌能有效缓减急性肠炎导致的肠屏障损伤。KARCZEWSKI等[57]研究表明，十二指肠灌注植物乳杆菌能有效促进人肠道紧密连接蛋白的表达。GUO等[50]以Caco-2单层上皮细胞为模型，探究得出嗜酸乳杆菌能有效缓减IL-1β导致的肠上皮屏障损伤。此外，自然杀伤细胞能保护肠上皮细胞屏障免受病原体侵袭，QIU等[58]认为，植物乳杆菌能够诱导自然杀伤细胞转移并分泌IL-22，缓减大肠杆菌导致的肠上皮屏障损伤。

奶牛血乳屏障是动物乳腺防御病原菌入侵的第一道防线，起着重要的物理屏障和免疫防御作用[59]，其结构和功能的完整性直接关系到奶牛的乳腺健康及其对乳房炎致病菌的抵御能力。以上研究证实，乳酸菌能够通过促进肠道上皮紧密连接蛋白的表达，保护其屏障结构和功能的完整性。因此，乳酸菌能否增强奶牛血乳屏障功能，进而实现奶牛对乳房炎致病菌的有效防御值得深入探究。

4.2 口服乳酸菌缓减奶牛乳房炎传统上乳腺和微生物之间被认为严格存在“宿主-病原体”之间的互作关系，即微生物侵入乳腺组织会引发炎症反应[60]。但最近的宏基因组学研究表明，健康乳腺的分泌物中含有不同细菌群的基因组标记，这些微生物绝大部分与哺乳动物的乳房炎无关，被称为“共生乳腺微生物群”，此概念的出现对传统观点“健康的乳腺内无菌”提出了挑战[22]。此外，不少研究证实从健康女性乳汁中可分离得到产气乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌等，并证明其具有与商业益生菌相似的益生性[61]。研究表明，乳酸菌可通过肠道上皮树状细胞的内吞作用穿透小肠上皮，再沿肠-乳通路经内循环直接到达乳腺[62]。2018年，SHIVELY等[63]研究证明，饮食能够改善乳腺微生物的组成，增加其中乳酸菌的丰度。TED等[64]用宏基因组学对人肠道和乳汁中的微生物群落结构进行了研究，得出肠道细菌可能源自乳汁，并提出肠道菌群的形成又会对乳腺菌群产生影响的结论。因此，口服乳酸菌可能具有优化乳房内微生物区系，进而有效防治奶牛乳房炎的作用。

已经证实，口服乳酸菌在治疗女性乳房炎方面具有较好的效果。JIMENEZ等[65]研究发现，口服加氏乳杆菌能够有效缓减患葡萄球菌性乳房炎女性的临床症状。ARROYO等[66]研究表明，口服发酵乳杆菌和唾液杆菌后，患者乳样中的平均细菌数显著低于服用抗生素组，且其乳房炎症状明显改善、复发率降低。LEONIDES等[67]研究结果显示，给妊娠约30周至哺乳期间的孕妇口服唾液乳杆菌，其哺乳期3个月内的乳房炎发病率和乳中的细菌数均显著降低。

MA等[17]于2018年指出：通过奶牛到小鼠的跨物种粪菌移植，证实失调的肠道菌群可能是引发乳腺炎的原因之一，口服恢复肠道菌群功能的益生菌(如该研究使用的干酪乳杆菌)是潜在的治疗策略。以上研究表明，口服乳酸菌能够有效缓减女性或小鼠的乳房炎。但对于反刍动物而言，目前还没有关于通过口服的方式摄入乳酸菌，使其通过肠-乳途径到达乳腺发挥作用的研究。因此，口服乳酸菌能否有效缓减奶牛乳房炎，又是通过何种途径实现防治效果值得探索。

5 小结

乳房炎是奶牛发病率较高的常见疾病之一，给奶业生产带来了巨大的经济损失。奶牛临床性乳房炎的治疗主要依赖于抗生素，而抗生素滥用带来的致病菌耐药性传播和抗生素残留等问题给环境保护和食品质量安全带来巨大挑战。作为抗生素的潜在替代品，乳酸菌在防治病原微生物方面很有潜力。研究表明，乳导管注射乳酸菌能够有效防治奶牛的乳房炎，这可能是通过抑制致病菌的定植和黏附以及调节机体免疫功能等途径实现的。但乳腺正常状态下较少受到微生物刺激，为有效规避乳酸菌自身诱发乳腺炎症反应的风险，在通过乳导管注射的方式防治奶牛乳房炎时，菌株选择、宿主生理阶段和用量等值得关注。此外，乳酸菌对血乳屏障的作用效果及机制，口服乳酸菌能否成为缓减奶牛乳房炎的有效途径值得深入研究。