CRISPR/Cas9技术在猪常见病毒性疾病防控中的应用

魏 楠，谷 峰

(中国农业科学院 上海兽医研究所，上海200241)

成簇规律间隔短回文重复与Cas9蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9)是第三代基因组编辑技术。基因组编辑技术基于基因靶向修饰，从而实现对目标基因定点敲除和外源基因定点整合，已经被用于多种模式动物的品种改良和疾病防治，基因组编辑技术先后经历了大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZNF)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)等技术的发展。CRISPR/Cas9技术作为目前应用最广泛的基因编辑工具，为预防和控制病毒感染提供了新的思路，例如可用于全基因组筛选病毒毒力基因、通过靶向病毒基因缺失或突变生产减毒疫苗、研发动物抗病育种等。

1 CRISPR/Cas9技术在猪病毒性疾病防控中的应用

猪临床上的病毒性疾病主要包括非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病、猪流行性腹泻和猪流感等，这些疾病都具有较高的发病率和病死率等特点，对养猪业的发展造成极大的威胁。猪作为一种重要的农业经济动物和大型模式动物，对其进行基因组编辑不仅能提高生产性能、加速新品种的培育，还为相关病毒性疾病的防治提供了新的思路。

1.1 非洲猪瘟非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,给全球养猪业带来巨大经济损失。猪巨噬细胞是ASFV的主要天然宿主细胞[1]，尽管被敲除的巨噬细胞表面蛋白CD163也被认为是一种潜在的ASFV受体，然而CD163基因编辑猪却不能抵抗ASFV的感染[2]。传统的ASFV疫苗研究存在不同程度的局限性，通过建立ASFV CRISPR/Cas9基因编辑技术平台，将为ASFV基因功能研究提供便捷的工具，加快疫苗研究进程。目前，CRISPR/Cas9已经被成功用于ASFV的基因编辑研究中。BORCA等[3]首次使用CRISPR/Cas9技术描述了基于高毒性ASFV-G基因缺失重组病毒的研究，以猪巨噬细胞培育强毒力毒株Georgia07，用CRISPR/Cas9从毒株基因组中敲除非必需基因8-DR，以红色荧光蛋白(RFP)基因代替，获得了重组效率高且易于纯化的重组病毒。HÜBNER等[4]首次证明，在表达相关基因的CRISPR/Cas9系统的细胞中，ASFV的复制可以被抑制，用CRISPR/Cas9靶向ASFV磷酸化蛋白p30基因(CP204L)71～78密码子的gRNA，稳定转染修饰野猪肺细胞系(WSL)，结果显示ASFV在WSL细胞中产量降低，表明CRISPR/Cas9介导的ASFV p30基因靶向是一种有效的抗ASFV感染的策略。

1.2 猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，又称为蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的，是高度传染的病毒性疾病，可导致猪的晚期流产、死胎和呼吸系统疾病，对全世界的养猪业造成巨大损失。相关研究表明,CD163是调控PRRSV感染初始阶段的关键因子[5]。2014年，美国密苏里大学WHITWORTH等[6]使用CRISPR/Cas9技术靶向2个内源基因(CD163和CD1D)来获得转基因猪。该团队后续研究表明,CD163基因编辑猪对 PRRSV NVSL 97-7895 病毒株有抵抗力，未表现出任何与 PRRS 相关的临床症状，且生长健康[7]。BURKARD等[8]获得了CD163外显子7敲除的猪，该猪表达缺失SRCR5的CD163蛋白，研究发现缺失SRCR5不影响猪巨噬细胞的生物学功能，而且该猪可抵抗Ⅰ型 PRRSV的1、2、3 亚型和Ⅱ型 PRRSV 的感染。WELLS等[9]将人类CD163 受体的SRCR8 结构域同源物替代了猪SRCR5 结构域，获得了对Ⅰ型 PRRSV 具有抵抗性，但对Ⅱ型PRRSV仍然敏感的猪。跨膜糖蛋白(4-1BB)是肿瘤坏死因子受体超家族的成员之一，是T细胞协同刺激分子。HUANG等[10]通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，获得了高表达4-1BB的猪，该猪对PRRSV疫苗的免疫反应结果表明，高水平4-1BB的表达能够促进Th1分化和增强对PRRSV的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，该研究提供了一种新的策略来提高疫苗的免疫效力。

在高致病性PRRS的研究中，YANG等[11]采用CRISPR/Cas9技术获得CD163基因敲除猪，该猪能完全抵抗HP-PRRSV TP毒株感染，另外，有研究者用CRISPR/Cas9技术获得CD163外显子7敲除猪[12]，或者将猪CD163的外显子7替换为人类的相应外显子(hCD163L1)[13]，所获得的基因编辑猪可抵抗HP-PRRSV相关毒株的感染，如JXA1、JXwn06等，且对CD163的生物学功能无不良影响。

1.3 猪伪狂犬病猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的猪急性传染病，主要引起仔猪出现神经症状、腹泻呕吐，病死率高达100%，妊娠母猪流产、死胎等，严重危害全球猪养殖业。PRV是α疱疹病毒亚科的成员，基因组为线状双链DNA分子，约150 kb，由于PRV基因组很大，传统基因操作方法费时费力，而CRISPR/Cas9技术不失为一种快捷可行的方法。

1.3.1PRV疫苗生产 2011年，PRV毒株发生变异，传统的Bartha-K61疫苗未能提供对变异株的完全保护，对有效的疫苗开发提出了迫切的需求。XU等[14]首次使用CRISPR/Cas9技术用于PRV 基因组编辑，将纯化的PRV 基因组与Cas9 sgRNA 共转染到PK-15细胞中，获得高达100%病毒基因破坏率。LIANG等[15]提出了一种基于CRISPR/Cas9和Cre/Lox系统的快速疫苗开发策略，使用CRISPR/Cas9技术，PRV毒力基因GE和TK分别被标记基因GFP和mCherry取代，随后用Cre/Lox系统切除标记基因，成功获得了第1个基于CRISPR/Cas9技术的PRV候选疫苗。TANG等[16]获得了一种表达萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组PRV 毒株，作为PRV 特异性的sgRNA 筛选和抗病毒化合物快速评估的报告病毒。最后，利用该报告病毒，成功开发了US2、US3和US9灭活的PRV 毒株，并证明氯喹抑制PRV HeN1毒株复制。TANG 等[17]设计了一种使用CRISPR/Cas9技术编辑PRV 基因组的方法，以快速减毒PRV,开发了三重gE/gI/TK基因灭活的HeN1 PRV 毒株，该方法也适用于其他的难以操作的大型DNA 病毒。新出现的PRV 变异株JS-2012的糖蛋白B(gB)基因与疫苗株Bartha -K61相比有多个变异，YU等[18]用CRISPR/Cas9技术成功获得了以Bartha-K61基因组为骨架，Bartha-K61 gB基因被替换为JS-2012 gB基因的重组病毒BJB，用灭活的 BJB 对小鼠进行免疫接种，攻毒结果显示BJB 的保护率是80%， 该研究表明了gB基因在保护性免疫中的重要性。SUI等[19]通过CRISPR/Cas9技术成功获得了猪核糖核酸酶L(sRNase L)基因敲除的PK-15细胞系，研究结果显示与亲代PK-15细胞系相比，病毒在该细胞系中产量更高，该细胞系可作为研究sRNase L 功能和优化PRV 疫苗生产的工具。

1.3.2PRV 毒力基因研究 TANG等[20]使用CRISPR/Cas9技术敲除了10个潜在的PRV 毒力基因，并在小鼠模型中评估了各突变体的致病性，结果显示胸苷激酶(TK)和糖蛋白M(gM)基因敲除突变体的毒力显著降低，显示TK和gM是PRV的关键毒力基因。而YE等[21]采用CRISPR/Cas9技术分别获得UL24和TK 基因缺失PRV 病毒，其研究显示与TK基因相比，UL24是一种次要的PRV 毒力基因。

1.3.3PRV 逃避CRISPR/Cas9抑制及其机制研究 病毒从CRISPR/Cas9介导的抑制中逃逸可能会限制该技术在病毒防制中的应用，而相关研究表明PRV可以逃避CRISPR/Cas9介导的抑制。PENG等[22]使用CRISPR/Cas9技术获得了敲除PRV UL30基因的PX459细胞系，可显著抑制PRV 的复制，然而随着细胞传代的增加，病毒滴度也逐渐增加，发现了PRV 可以逃脱CRISPR/Cas9系统的抑制。REN等[23]进一步研究阐明了经过编辑的PX459细胞传代对CRISPR/Cas9介导的PRV复制没有影响。TANG等[24]研究证实了单个sgRNAs 靶向会产生PRV 逃逸，而多个sgRNAs 同时靶向完全抑制PRV 复制，强调了多靶向的重要性。

1.3.4在PRV其他方面的应用 GUO等[25]使用CRISPR/Cas9技术大幅度提高同源重组的效率，建立了一种快速的插入大基因组细菌人工染色体BACs 的方法，重组效率高达86%。α疱疹病毒的病毒宿主关闭蛋白基因UL41被认为可诱导降解宿主mRNAs 并关闭宿主蛋白质合成，在PRV 的宿主关闭机制研究中，YE等[26]利用CRISPR/Cas9结合Gibson 组件获得了UL41基因敲除的PRV,结果显示该病毒不能显著降低感染早期宿主基因的表达量，表明PRV 的其他病毒因素也可能参与宿主关闭。

1.4 猪病毒性腹泻猪病毒性腹泻是一种急性的猪消化道传染疾病，仔猪最易感且病死率高，临床症状表现为呕吐、严重腹泻和脱水，引起该病的主要病原包括猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和轮状病毒(rotavirus,RV)，该病给全球养猪业造成了巨大的经济损失。

1.4.1TGEV TGEV是α属冠状病毒，是一种包膜、单股正链的RNA病毒。氨基肽酶N(APN)被认为是多种α冠状病毒的受体，包括TGEV[27]、PDCoV和人冠状病毒229E(HCoV-229E)。冠状病毒spike蛋白的N末端结构域也被认为是导致该病不同临床症状的原因。WANG等[28]用CRISPR/Cas9技术构建了一个TGEV spike基因N端域224个氨基酸缺失的重组病毒，其结果表明，spike基因N端域的缺失对TGEV的毒力影响较小，spike蛋白的N端域不是TGEV的毒力决定因子。SHEN等[29]研究则表明α属冠状病毒的nsp1蛋白是TGEV重要的毒力决定因子，使用CRISPR/Cas9技术构建重组TGEV，改变了nsp1的特定序列，发现该突变不影响病毒的复制，但降低了TGEV的致病性，还发现α属冠状病毒nsp1的特定序列(氨基酸91～95)是抑制宿主基因表达的保守区域，该结果为开发基于修饰nsp1的减毒疫苗提供了参考。

1.4.2PEDV PEDV是α属冠状病毒，尽管APN被认为是多种α属冠状病毒的受体，但相关研究证明APN基因编辑猪不能抵抗PEDV的感染，APN对PEDV的入侵感染不是必需的[30-32]。为了探究淋巴毒素β受体(LTβR)在PEDV感染中的作用，ALTAWATY等[33]用CRISPR/Cas9技术获得了LTβR敲除IPEC-J2细胞，LTβR的缺乏导致细胞S期积累，增加了细胞对PEDV感染的易感性，表明LTβR介导的信号传导在维持IPEC-J2细胞增殖和保护IPEC-J2细胞免受PEDV感染中起关键作用，但其调节机制还需进一步研究。TU等[34]用CRISPR/Cas9技术获得了胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因敲除的仔猪，使N-羟乙基神经氨酸(NGNA)无表达，攻毒结果显示该猪不能对PEDV免疫，但可以减轻PEDV感染的严重性并延缓其发生。

1.4.3RV RV是重要的人畜共患病原之一，是引起婴幼儿和多种幼龄动物急性腹泻的主要病原体之一，其基因组由11段双链RNA组成，编码6种病毒结构蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和5种非结构蛋白(NSP1～NSP5/6)，在9个RV基因组(A～I)中，RVA、RVB、RVC和RVH与仔猪腹泻有关。

研究者用CRISPR/Cas9技术编辑用以生产RV疫苗的Vero细胞[35-37]，编辑了细胞的NUE2、NAT9、COQ9、EMX2等基因，使RV产量显著增加，改进了RV在Vero细胞系产量较低的问题。LI等[38]在研究RV感染的机制中发现，在RV感染期间一种肌动蛋白结合蛋白drebrin(DBN1)与VP4共沉淀和共定位，通过siRNA沉默、CRISPR敲除或化学抑制阻断DBN1功能，显著提高了宿主细胞对RV的易感性，表明DBN1基因有限制RV进入宿主细胞的能力。在翻译启动因素调节RV感染的机制研究中，CHEN等[39]分析了真核翻译起始因子4F(eIF4F)复合物在RV感染中的作用，使用CRISPR/Cas9技术分别对eIF4F复合物的组分进行敲除，结果eIF4F的3个组分(包括eIF4A、eIF4E和eIF4G)功能丧失，均显著提升了RV基因组RNA和病毒蛋白VP4的表达水平，还证实eIF4F复合物是通过调节抗病毒蛋白IRF1和IRF7来抵抗RV感染。DING等[40]用CRISPR/Cas9全基因组筛选促进RV感染的宿主因子，研究表明Cohesin 蛋白的核心亚基STAG2会促进RV感染，STAG2的缺失会激活cGAS-STING-IRF3信号传导途径诱导干扰素应答，并广泛限制病毒(包括RV)感染，STAG2突变在多种肿瘤类型中被检测到，该研究结果可为相关肿瘤的治疗提供参考。

1.5 猪瘟猪瘟俗称“烂肠瘟”，又称古典猪瘟，是一种传染性极强的病毒性疾病，由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起，CSFV为单股正链RNA病毒，病毒基因组编码一种多蛋白前体，该前体进一步被蛋白酶水解为4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[41]。NS4B蛋白对病毒RNA复制至关重要，且与CSFV毒力有关[42]，有研究表明RING E3泛素连接酶通过各种机制抑制病毒复制[43]。猪RNF114蛋白(pRNF114)是RING E3泛素连接酶的成员，ZHANG等[44]使用CRISPR/Cas9技术在PK-15细胞中敲除RNF114，促进了CSFV的复制，研究结果表明pRNF114是一种抗CSFV因子，其抗CSFV作用取决于其RING E3泛素连接酶的活性，pRNF114结合NS4B蛋白，并催化NS4B蛋白K27连接的多聚泛素化，引起NS4B蛋白降解从而抑制CSFV的复制。XIE等[45]筛选了抗病毒小发夹RNA(shRNAs)，通过CRISPR/Cas9技术将其插入猪Rosa26基因座，并成功获得了抗CSFV感染的基因编辑猪，其抗病性可以稳定地传递到F1代。RSAD2基因具有针对多种DNA和RNA病毒的抗病毒活性，XIE等[46]用CRISPR/Cas9技术将猪RSAD2基因(pRSAD2)插入猪Rosa26基因座，并成功获得可以抵抗CSFV感染的猪。

1.6 猪圆环病毒病猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)的血清型有PCV1、PCV2和PCV3。PCV1无致病性，PCV2、PCV3为致病性的病毒，PCV2与一系列疾病的发生有关，这些疾病被称为猪圆环病毒相关疾病，如断奶后多系统消瘦综合征、猪皮炎肾病综合征等。有研究表明，PCV2感染通过上调P53诱导细胞凋亡，XU等[47]使用CRISPR/Cas9技术获得了p53基因敲除的PK-15细胞系，进一步探究p53 在PCV2感染中的作用，结果表明在PK-15细胞中，PCV2通过p53调控p21、Cyclin E的上调和Cyclin A、CDK 2蛋白的下调诱导细胞S期积累，从而维持其自身复制。SYNGR2基因是一组主要在神经元细胞突触囊泡膜中表达的基因，WALKER等[48]研究结果显示PCV2b(UNL2014001)毒株在SYNGR2基因敲除的PK-15细胞中病毒产量降低，为SYNGR2参与促进PCV2感染提供了证据。

1.7 猪流感猪流感(swine influenza,SI)是由甲型流感病毒(IAV)引起的猪急性呼吸道传染病，不仅给养猪业造成危害，对人类健康也具有潜在威胁。目前,猪群中流行的IAV以H1N1、H1N2和H3N2亚型为主，这里简要回顾了CRISPR/Cas9技术在IAV相关研究中的应用。

1.7.1IAV与宿主相互作用机制研究 CRISPR/Cas9技术可应用于探究IAV与宿主之间相互作用机制，为IAV的防控提供线索。IAV基因组的转录和复制发生在感染细胞的核内，宿主对抗IAV感染的有效途径是靶向核导入。刘丽素等[49]用CRISPR/Cas9技术在人肺癌细胞A549中敲除核输入蛋白 importin α7，研究importin α7 对不同来源和亚型的流感病毒生长的影响，其结果表明不同亚型流感病毒结合 importin α的特异性不同，流感病毒可能进化出不同机制来利用importin α亚型进行核输入。LUO等[50]研究显示用CRISPR/Cas9技术在细胞中敲除磷脂爬行酶1(PLSCR1)的表达促进了多种亚型IAV复制，证明了PLSCR1是对抗IAV感染的重要因素，其机制是PLSCR1与核蛋白(NP)和importin α家族成员形成三聚体复合物，该复合物抑制了importin β与importin α形成功能性核导入受体复合物，损害NP的核导入从而抑制IAV复制，PLSCR1不影响NP的磷酸化状态，也不激活IFN途径。IAV在感染过程中利用多种宿主蛋白，SAMMAIBASHI等[51]用CRISPR/Cas9技术获得了真核翻译延长因子1γ(eEF1G)敲除A549细胞系，在该细胞中，A/WSN/33(H1N1)病毒的复制和蛋白表达受到显著抑制，但病毒基因表达水平未降低，表明eEF1G在病毒蛋白的转化中起着重要的作用，还验证了WSN病毒的PB2和PA蛋白受eEF1G的调控，但具体机制仍需进一步的研究。许多病毒在进入细胞后会下调p53从而减弱宿主的抗病毒反应，但IAV感染会上调p53。WANG等[52]用CRISPR/Cas9技术获得p53敲除的A549细胞，p53的缺失可引起IAV产量降低，其研究表明激活p53途径是IAV感染过程中的重要步骤，通过上调p53，抑制干扰素诱导跨膜蛋白(IFITMs)的表达从而维持IAV感染。

1.7.2IAV疫苗开发和抗病毒策略研究 miR-21在流感病毒易感宿主中普遍表达，WARING等[53]用CRISPR/Cas9技术获得了miR-21敲除的MDCK细胞系，成功开发了一种新的IAV疫苗生产方法。有研究表明，流感病毒感染依赖于细胞脂质，包括鞘脂、鞘磷脂和鞘氨醇。DREWS等[54]用CRISPR/Cas9技术获得了敲除葡萄糖神经酰胺酶(GBA)基因的HEK293和A549细胞系，观察到PR8(H1N1)绿色荧光蛋白(GFP)报告病毒在2种细胞系中的产量降低，结果表明病毒产量降低与IAV的运输受损有关，证明了GBA对于病毒以及细胞物质的内吞运输至关重要。长链非编码RNA(lncRNA)是一种新的基因调控机制，关于lncRNA与流感病毒感染期间基因表达调控和抗病毒活性有关的研究较少。MORE等[55]鉴定了涉及IAV复制的lncRNA，证明了PSMB8反义RNA 1(PSMB8-AS1)是一种促进IAV复制的lncRNA，PSMB8-AS1可能是开发抗IAV治疗新的宿主因子靶点。SANYAL等[56]用CRISPR/Cas9技术参与编辑，探究NF-κB在IAV感染中的作用，结果表明IAV的基因型影响NF-κB是否显示其抗病毒功能。

2 结束语及应用前景

猪作为一种重要的农业经济动物和医学动物模型，其选育和疾病防控越来越受到人们重视，尤其是近年非洲猪瘟疾病的流行对我国乃至全球养猪业造成了重大的经济损失。新型基因编辑技术CRISPR/Cas9在猪相关领域的研究已经得到广泛应用，比如在抗病育种、疫苗生产、异种器官移植、疾病模型构建、药物靶点挖掘和疫病防制等方面。CRISPR/Cas9技术在猪病毒性疾病防控领域具有较高的科研价值和临床治疗意义，合理地应用CRISPR/Cas9技术，可探究病毒基因的功能、筛选毒力基因，探究病毒感染过程中关键的宿主因子和病毒因子，用于疫苗生产、研发抗病毒药物和抗病毒分子育种等，可为生物医学和猪养殖业的发展做出重大贡献，应用前景极为广阔。