牛传染性鼻气管炎疫苗的研究进展

李东丽，葛桂阳，刘 艺，郜艳雪，徐 宁，栾美慧，时 坤，李健明，冷 雪*，杜 锐

(1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室/吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室,吉林 长春 130118)

牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)又被称为“红鼻病”或“坏死性鼻炎”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)即牛疱疹病毒1型(BoHV-1)感染所引起的一种高度接触性传染病。IBRV是存在于牛体内的一种可导致牛出现呼吸困难、高热和流产等症状的疱疹病毒[1]。IBRV即牛疱疹病毒1型(bovine herpes virus type 1，BoHV-1)，是疱疹病毒科的成员，可编码73个蛋白[2]，其中gB、gC、gD和gE可诱导宿主发生免疫应答。IBRV可在三叉神经建立潜伏感染[3]，组织嗜性广，可感染呼吸系统、生殖系统、神经系统和眼结膜等[4]，并能够垂直传播。临床上患病肉牛育肥率会大幅度降低，患病母牛繁殖率可显著下降，且严重影响奶牛的产奶率，对全世界养牛业都存在着巨大的冲击。19世纪50年代在美国首次发现IBRV，我国则于20世纪80年代从新西兰进口牛中首次分离获得IBRV[5]。该病在世界范围内均有流行，世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)将其列为B类疫病，亦属于我国二类动物疫病。我国是IBRV感染率相对较高的国家，2013年之前我国IBRV感染率为32%，2013年以后升至43%[6]，目前主要通过疫苗免疫的手段来防控或根除此病。因此，现主要介绍IBR灭活疫苗和弱毒疫苗2种常规疫苗和亚单位疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗和病毒活载体疫苗4种基因工程疫苗的研究现状及优缺点，以期为IBR疫苗的研究与开发提供参考。

1 常规疫苗

1.1 灭活疫苗IBR灭活疫苗即IBRV灭活后与合适佐剂共同制成的疫苗。ROMERA等[7]用β-半乳糖苷酶替代gE基因，将其制成减毒活疫苗和灭活疫苗，研究表明2种制剂均可产生有效的免疫反应，且病毒的释放量减少，但是灭活疫苗的免疫效果不及减毒活疫苗。KAMARA等[8]制备含有氢氧化铝凝胶(algel)和油性佐剂(montanide)的IBR灭活疫苗，其中用β-丙内酯(BPL)对滴度为108.37TCID50/mL的IBRV进行灭活，这2种灭活疫苗均可诱导较好的抗体应答，是制备灭活疫苗佐剂的选择之一。据报道，将磺胺脂环糊精加入角鲨烷水溶液乳剂中(SL-CD/S/W)作为佐剂制备的IBR灭活疫苗效果好，且该佐剂将含水抗原悬浮液与即用型佐剂配方混合可产生非常稳定的乳液，因此，该佐剂在制备IBR疫苗中占重要地位[9-10]。虽然IBR灭活疫苗具有较好的安全性，但由于IBR灭活疫苗存在免疫期短、免疫原性较差、不能在体内增殖(基本不引起细胞免疫)等缺点，因此，灭活疫苗不是根除IBR最有效的疫苗。

1.2 弱毒疫苗弱毒疫苗即人工致弱或自然筛选的弱毒株经培养后制备的疫苗。冷雪等[11]用IBRV LN01/08株连继传70代获得IBRV LNM致弱疫苗，研究表明该弱毒疫苗的免疫期长达12个月，后备母牛免疫后未出现流产、死胎及木乃伊胎,1月龄犊牛及6～8月龄牛无异常临床症状，病毒分离数及排毒时间相较于强毒感染低。据报道，日本研制的“优质改良疫苗”在安全方面有很大突破，但是免疫牛的局部黏膜会出现弱毒增殖的现象[12]，不能达到彻底根除该病的效果。D'OFFAY等[13]将分离的6个IBRV野毒株进行了全基因组测序，3种分离物(2种呼吸道和1种胎儿)被鉴定为疫苗衍生的分离株，该研究表明IBR弱毒疫苗和野生型病毒之间的重组可以在自然条件下发生并引起疾病，这一结论体现了弱毒疫苗的不安全性。弱毒疫苗免疫效果优于灭活疫苗，但是大多数弱毒疫苗基本上均通过肌肉注射的方式进行免疫，易造成减毒不充分而引起母牛流产的现象。另外，弱毒疫苗免疫效果亦受运输、保存条件限制等多种因素的影响。

虽然弱毒疫苗存在长期散毒、潜伏感染、无法区分野毒感染和疫苗免疫等安全性缺陷，但是常规疫苗的研制和生产相对容易，而且有分析表明接种传统疫苗可使怀孕母牛因受IBRV攻击产生流产的风险降低60%左右[14]。因此，全球IBR常规疫苗的使用较为普遍。相信随着分子生物学技术的发展，常规疫苗的缺陷会得到改进。

2 基因工程疫苗

2.1 亚单位疫苗亚单位疫苗主要诱导机体产生体液免疫，可以改善抑制潜伏感染的情况，一般与佐剂配合使用来提高其免疫原性。IBRV诱导强烈的病毒特异性CD8 T细胞反应。HART等[15]鉴定出4种抗原为ICP4、ICP22和CIRC及1种包被蛋白UL49，对CD8 T细胞株表位特异性分析表明以上蛋白是IBRV免疫牛CD8 T细胞应答的主要靶点，是亚单位疫苗的主要候选抗原。TRUDEL等[16]将IBRV膜蛋白纯化后吸附在糖苷奎尔上与免疫刺激复合物(ISCOM)制成IBR亚单位疫苗，将其免疫IBRV抗体阴性的犊牛，与免疫商业减毒疫苗相比表现出高水平的免疫诱导，表明其作为亚单位疫苗的潜力。IBRV中的糖蛋白gB、gC和gD具有免疫原性，其中gD是免疫原性最好的可诱导机体产生中和抗体的糖蛋白，负责病毒在宿主细胞内的渗透，同时参与病毒的吸附和膜融合，可抑制病毒的复制，所以IBRV gD基因亚单位疫苗的应用更广泛[17-18]。CASTRUCCI等[19]研究了8种商业疫苗(灭活疫苗、改良弱毒疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗等)的效果，其中改良活疫苗和基因缺失疫苗预防效果较好，而亚单位疫苗不能对免疫牛起到全面临床保护，且接种后犊牛的病毒传播持续几天，表明亚单位疫苗存在的免疫效力问题。RANKIN等[20]选择颈部肌肉免疫的方法分别将截短分泌形式的糖蛋白D(tgD)和不同剂量的明矾、未甲基化CpG基序(CpG ODN)、明矾和CpG ODN两者组合接种小牛，结果显示接种含CpG ODN的tgD产生的免疫应答更强、更持久，同时引起的局部组织反应更温和，且显著减少鼻内病毒攻击后病毒排毒的时间，表明该佐剂的有效性较高。IBR亚单位疫苗的缺点在于无法在体内复制，并且接种量大，制作成本高，因此对于其广泛推广具有较大限制。

2.2 DNA疫苗DNA疫苗又被称为核酸疫苗或者基因疫苗，是基因工程技术在疫苗研究方面的一项重大突破。DNA疫苗与传统疫苗相比具有效果更加稳定、易于构建和生产成本低的优点，并且可诱导持久的细胞和体液免疫。IBRV的gD糖蛋白是制备DNA疫苗较好的选择之一，CHOWDHURY等[21]利用gD糖蛋白构建DNA疫苗后免疫水牛，可诱导水牛产生特异性和保护性的免疫反应。LANGELLOTTI等[22]研究ISA25、ISA206和Cliptox等3种佐剂对于IBR DNA疫苗的作用，结果表明以上3种佐剂均可诱导特异性体液和细胞免疫应答，可作为IBR DNA疫苗的有效佐剂。有报道称细胞因子、趋化因子和共刺激分子作为分子佐剂可用于调节DNA疫苗，且抗原和佐剂在免疫过程中始终在一起有利于疫苗免疫，同时免疫途径可影响分子佐剂的效果[23]。QUATTROCCHI等[24]研究了分别加入佐剂ESSAI 903110和MontanideTM1113101的含有IBRV gD序列的DNA疫苗，结果显示含有佐剂MontanideTM1113101的DNA疫苗可提高细胞免疫，并且能够减少病毒的排出。PETRINI等[25]为检测DNA疫苗对犊牛的安全性及有效性，分别注射4种疫苗：pVAX-tgD、pVAX-tgD与pVAX-48CpG共免疫、pVAX-UbiLacl-tgD-L、pVAX-UbiLacl-tgD-1与pVAX-48CpG共免疫，结果显示只有pVAX-tgD与pVAX-48CpG共免疫的疫苗在接种后56 d产生体液免疫。CASELLI等[26]用欧洲Cooper型BHV-1分离株(Ield strain 97/1TN)的扩增产物作为DNA模板获得野生型(gB/gD)和截短形式的糖蛋白基因(gBt/gDt)，并分别克隆到pVAX载体中，研究表明，截短的gBt/gDt疫苗通常比其野生型gB/gD疫苗诱导的以中和抗体的存在为特征的体液应答更加有效。近几年，大多数关于佐剂对于DNA疫苗影响的研究表明DNA疫苗佐剂的选择仍有一定局限性，且DNA疫苗效力低，因此，IBR DNA疫苗的大范围使用依然不理想，不适用于IBR感染率较高的国家或地区，并且关于其体液免疫效果仍需深入研究。

2.3 基因缺失疫苗随着分子生物学技术的发展，IBR基因缺失疫苗已成为该病疫苗研究的主要方向之一。基因缺失疫苗最主要的特点是由于其某一相关毒力基因部分或者完全缺失，诱导机体产生的抗体与自然感染产生的抗体有所不同[27]，可用于区分自然感染牛和免疫接种牛。基因缺失疫苗凭借其毒力较弱、毒力返强的可能性低和潜伏感染的可能性低等优点，已经在欧洲普遍使用[28]。

2.3.1未插入外源基因的IBR基因缺失疫苗 糖蛋白gE是IBRV最主要的功能蛋白之一，与gB、gC、gD相比抗原性较差，但是gE可以在病毒表面进行高水平表达，影响病毒在感染细胞中的释放而降低病毒的传播。据报道，重复使用灭活和减毒的gE缺失标记疫苗，尤其在冬季对接种疫苗的牛群进行适当管理可缩短根除IBRV的时间[29]。SILVA等[30]研究IBRV gE缺失灭活疫苗发现其有效性较好，皮质类固醇给药试验发现虽然该疫苗引起的再活化现象较轻，但不能阻止病毒的潜伏感染。胸腺激酶TK是IBRV主要毒力基因中的一员，是其复制的非必需因子，因此很多学者将TK基因作为IBR基因缺失疫苗研究的重点。早在1999年，张桂红等[31]就针对该基因构建了IBRV TK基因缺失株，通过切除TK基因中的347 bp片段，获得该基因缺失突变株。CHOWDHURY等[32]通过鼻内接种的方法比较其构建的三基因缺失突变的IBR疫苗(缺失UL49.5腔内残区30～32个氨基酸和胞质尾部残区80～96个氨基酸、gE胞质尾部残区和US9全基因)和gE基因缺失疫苗的保护效果，结果显示2种疫苗均可对接种IBRV的小牛起到保护作用，并且三基因突变的IBR疫苗至少可以比gE基因缺失疫苗提前3 d清除IBRV。另外，接种三基因突变IBR疫苗组IFN浓度明显升高，IFN反应更迅速，即该疫苗介导的细胞免疫应答更好。

2.3.2插入外源基因的IBR基因缺失疫苗 IBRV有较大的基因组，且含有gC、gE、gG和TK等非必需基因，可以将1个或者多个外源基因插入其非必需基因位点后进行表达制成多价疫苗。李继昌等[33]制备了IBRV的通用转移载体pSdTK-CMB，可以在该载体内插入牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)等。REN等[34]将口蹄疫病毒(FMDV)株(O/China/99)的VP1基因插入IBRV基因组的gE基因中，成功构建出重组病毒IBRV/gE-/VP1， 重组病毒IBRV/gE-/VP1可诱导兔体产生抗IBRV和FMDV VP1蛋白的抗体，研究表明重组病毒IBRV /gE-/VP1有可能被开发成FMDV/IBRV二价疫苗。BATRA等[35]评估了IBRV作为溶血性曼氏杆菌免疫原载体的潜力，用外膜蛋白PlpE代替糖蛋白gC，携带嵌合Lkt(公认的在BHS 溶血性曼氏杆菌引起肺炎的毒力因子)-plpE基因的载体疫苗，编码溶血性曼氏杆菌Lkt的中和表位与溶血外膜蛋白PlpE的免疫显性暴露区，研究表明其是用于免疫大角羊(BHS)的合适载体，但是产生的抗体不足以保护BHS免受溶血性曼氏杆菌攻击，用嵌合插入物的额外试验对于开发更有效的疫苗是必需的。

IBR基因缺失疫苗与合适佐剂共同免疫可增加疫苗的免疫效果，但是对基因缺失疫苗的安全性存在质疑，针对基因缺失疫苗可能引起怀孕母牛流产、向外排毒等情况，进一步优化基因缺失疫苗是当前研究的首要任务。

2.4 病毒活载体疫苗病毒活载体疫苗是近几年疫苗领域研究的热点之一，病毒活载体疫苗可诱导细胞免疫、体液免疫以及黏膜免疫，病毒活载体疫苗的应用可大大降低养牛业经济损失，达到一针多防的效果。IBRV中的糖蛋白gB、gC、gD具有免疫原性，其中gD是制备亚单位疫苗和基因缺失疫苗的常用糖蛋白，近几年，gD也成为IBR活载体疫苗的研究热点之一。DONOFRIO等[36]根据牛疱疹病毒4(BoHV-4)可容纳大量外来基因和几乎无致病性和致癌性等生物学特性，将其作为基因递送载体，使用MuA转座酶介导的体外转位，产生表达IBRV的免疫原性糖蛋白D(gD)的重组BoHV-4，并将该重组病毒免疫兔后，可产生高水平的针对IBRV的中和抗体。KHATTAR等[37]用新城疫病毒(NDV)疫苗株LaSota作为疫苗载体，制备了rLaSota/gDFL(表达gD而没有任何修饰)和rLaSota/gDF(表达了一种嵌合gD，其中胞外域gD融合了NDV融合F糖蛋白的跨膜结构域和胞质尾)2种重组病毒，结果表明NDV可作为IBR疫苗的载体，由于只产生部分保护，所以可能需要增加免疫次数。目前，IBR病毒活载体疫苗的研制相较于其他IBR疫苗研究较少，相信在不久的将来该疫苗会弥补其他IBR疫苗的不足，为IBR的防控和根除提供有效的帮助。

3 我国近年IBR研究和应用疫苗情况

IBR对养牛业的危害严重，国外已研制了多种疫苗用于该病的防控[19]。而我国IBR疫苗的研究相对起步较晚，且近年来才有相关疫苗上市，如由中国兽医药品监察所和金宇保灵生物药品有限公司等联合研制的牛病毒性腹泻/黏膜病、IBR二联灭活疫苗(NMG株+LY株)、北京生泰尔科技股份有限公司和北京华夏兴洋生物科技有限公司等联合研制的IBR灭活疫苗(C1株)，分别于2016年和2019年获批新兽药证书。此外，还有一些相关产品进入临床试验阶段，如牛病毒性腹泻/黏膜病、IBR二联灭活疫苗(1型，NM01株+LN01/08株)、IBR活疫苗(LNM株)和IBR、副流感3型二联灭活疫苗(C1株+HB0株)。除上述常规疫苗外，IBR基因工程疫苗的研究也取得了一定的进展。魏鑫[38]用分离的IBRV NMHS-1株构建gD亚单位疫苗进行免疫家兔试验，结果表明该疫苗有很好的免疫原性。杨姣[39]对IBRV gG-/TK-双基因缺失疫苗进行安全性试验，结果表明该疫苗安全性良好，且肌肉注射途径可诱导更高的免疫水平；对IBRV gN-/TK-/gG-三基因缺失重组株进行兔体试验，结果表明该疫苗具有较好的免疫原性。穆艳霞[40]利用CRISPR/Cas9系统成功高效地构建了IBRV gE缺失株，并对其生物学特性进行分析，结果表明gE基因的改变和缺失不影响病毒复制，且毒力减弱。以上研究为IBR基因工程疫苗的研究奠定试验基础，并具有重要的参考价值。

4 展望

IBR是目前我国牛传染病中感染率较高的一种传染病，有研究表明孕酮可通过增加IBRV潜伏期重新激活的频率，在一定程度上促进了牛体内IBRV的传播[41]。IBR还可与牛病毒性腹泻-黏膜病等病毒发生混合感染，增加养牛业的经济损失。目前并无有效药物治疗IBR，针对该病毒最有效的措施即接种疫苗。虽然灭活疫苗和弱毒疫苗应用较早，在IBR的防控中发挥了重要作用，但是这2种疫苗存在免疫原性差、运输不方便等问题。随着基因工程技术的发展，IBR亚单位疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗和病毒活载体疫苗这4种基因工程疫苗的研发将弥补常规疫苗的安全性等问题，其中IBR基因缺失疫苗因其能够降低病毒的致病性且制成疫苗后能够与野毒株进行鉴别诊断成为近几年研究的主流方向，相信随着基因工程技术的蓬勃发展和新型佐剂的开发，定会提高疫苗的安全性及免疫保护效果，为研制安全有效的IBR疫苗奠定基础，从而为进一步根除IBR发挥重要作用，助力养牛业的健康发展。