MARCH1在免疫及肿瘤等方面的研究进展

王暖 杨丽娟 刘成霞

1滨州医学院附属医院消化内科，山东 256600；2滨州医学院附属医院肿瘤研究实验室，山东 256600

2001年，Coscoy等［1］在病毒中发现能够通过抑制主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHC-Ⅰ）促进病毒免疫逃逸的两种跨膜蛋白，即K3和K5。通过生物信息学的方法在哺乳动物中发现与K3、K5蛋白结构和底物相似的一类蛋白家族，该类蛋白具有E3泛素化连接酶活性，将其称为膜相关环状蛋白家族（membrane associated RING-CH，MARCH）［2］。MARCH家 族 包 括MARCH 1～11，MARCH家族成员分布广泛，参与多种生理功能，比如精子发生、膜转运、脂质合成等。其中MARCH1基因位于4号染色体短臂，编码蛋白分子量32 kDa，在淋巴结和脾脏中高表达，其通过将主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHC-Ⅱ）和其他蛋白分子引导至溶酶体区室，泛素化降解来下调其表达水平，进而参与抗原提呈过程，可见MARCH1在免疫系统中发挥重要作用［3］。近来研究发现MARCH1不仅是重要的免疫调节因子，还与免疫相关疾病、肿瘤、代谢等疾病的发生发展密切相关。研究表明，MARCH1参与了先天性炎症和过敏性哮喘炎症因子和炎性细胞的释放［4-5］，并通过泛素化MHC-Ⅱ影响多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的病程进展［6］。在肿瘤研究方面，MARCH1以促癌基因或抑癌基因的角色参与了卵巢癌、肝癌和膀胱癌的发生发展［7-9］。Zhang等［10］研 究 发 现，MARCH1可以降低人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）活性进而降低病毒感染率，MARCH1可能是治疗艾滋病的一个新靶点。Bhagwandin等［11］报道MARCH1调控胰岛素受体信号传导进而可能在代谢方面有重大研究前景。可见MARCH1在各种疾病中的作用逐渐受到重视，本文通过对MARCH1的表达调控，在免疫系统中发挥的生物学效应以及在疾病中发挥的作用等方面进行综述。

1 MARCH家族

泛素化是一种多种酶参与的，将泛素加到特定底物蛋白上使其发生泛素化修饰，进而发挥特定功能或者蛋白酶体降解的翻译后修饰。泛素化涉及3步反应，首先游离泛素与泛素激活酶（E1）结合，然后转移至泛素结合酶（E2），最后通过泛素连接酶（E3）附着于底物蛋白。MARCH家族是近年来新发现的一种E3［12］。K3和K5是由卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）编码的含RING-CH的E3，在免疫逃逸中起重要作用。通过生物信息学的方法，MARCH蛋白确定为K3和K5的细胞直系同源物。在其他病毒（例如痘病毒和黏液瘤病毒）里也发现类似E3，进一步证明E3可能源自相应的宿主细胞［13］。

哺乳动物中共含有11种MARCH蛋白，它们都具有E3活性的N末端的RING-CH结构［14］。除了MARCH7和MARCH10外，其他MARCH家族成员蛋白还具有2个或多个TM跨膜结构域，同时MARCH7和MARCH10的RING-CH结构更接近蛋白的C末端。一些MARCH蛋白还具有其他结构域，比如介导蛋白相互作用的C末端PDZ结合域、可能参与胞吞作用的C末端基于酪氨酸的YXXΦ结构域［15］。进一步研究表明，4对MARCH蛋白（MARCH1/8、MARCH2/3、MARCH4/9、MARCH7/10）彼此之间密切相关，具有结构同源性，它们共享相似的底物。但是，这些蛋白的结构序列并不完全相同，比如MARCH4/9的RING-CH结构和TM结构中超过90%的残基相同，MARCH2/3在以上结构域中约有60%的同源性［16］。

2 MARCH1结构和表达调控

MARCH1又称RNF171，是MARCH家族成员之一，它主要由N端的RING-CH结构和两个跨膜TM结构域组成［3］。MARCH1在大多数组织中均以非常低的水平表达，但在淋巴结和脾脏中高表达，细胞水平MARCH1在次级淋巴组织、B细胞、单核细胞和未成熟的树突细胞中高表达，可见在免疫系统中发挥很重要的作用。研究表明，白细胞介素-10（IL-10）能够诱导MARCH1的表达［7］，但只是在mRNA水平上调MARCH1，在蛋白水平检测仍较困难，提示MARCH1发生了转录后修饰。MARCH1在转录后调控原因可能是MARCH1通过二聚体化和自身泛素化调节自身的表达［17］。Jabbour等［18］研究发现在鼠源性的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）中，MARCH1的半衰期小于30 min，抑制溶酶体活性稳定了MARCH1，同样的使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂观察到类似的稳定作用，提示其降解部分发生在溶酶体中。APC在未成熟状态时，MARCH1表达水平较高，从而通过下调MHC-Ⅱ和CD86抑制未成熟APC的抗原提呈功能，当APC成熟时，MARCH1以较低的水平发挥E3作用迅速诱导其抗原提呈。所以，MARCH1不仅通过自身泛素化调控表达水平，而且在APC不同成熟阶段发挥不同的作用，这种表达调控方式有助于MARCH1更好地参与抗原提呈的过程。

3 MARCH1与免疫

MARCH1在淋巴细胞发育过程中起到非常关键的调控作用，已经确定的MARCH1靶标分子：MHC-Ⅱ、CD86、CD98、HLA-DR、HLA-DM等［13］。MHC-Ⅱ分子的主要功能是向CD4+T细胞呈递抗原从而在细胞免疫应答中发挥重要作用。MHC-Ⅱ的表达和半衰期是通过泛素化来控制的，MHC-Ⅱβ链的胞质尾部含有一个保守的赖氨酸残基，该残基通常在小鼠和人类的B细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）和单核细胞中被多聚泛素化［19］。尽管MHC-Ⅱ被泛素化的具体细胞位置还未知，但是负责E3的是MARCH家族成员。MARCH1的主要功能是泛素化抗原提呈细胞上的MHC-Ⅱ，研究发现在未成熟的DC中MARCH1高表达并且在DC的成熟过程中表达逐渐被下调［20］。B细胞中MARCH1的表达水平非常高，而且MARCH1的强表达诱导了MHC-Ⅱ的泛素化。在MARCH1缺陷小鼠的B细胞中，MHC-Ⅱ的表面半衰期延长，泛素化形式则完全消失［21］。而且缺乏MARCH1的B细胞表面高表达负荷外源性抗原的MHC-Ⅱ，并显示出较高的呈递抗原的能力。还有研究表明在B细胞中MARCH1通过泛素化MHC-Ⅱ促进了MHC-Ⅰ表达的升高，MHC-Ⅰ主要通过内源性抗原提呈的作用将抗原呈递给CD8+T细胞，所以推测MARCH1具有共同调节MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的作用［22］，虽然这种调节对CD8+T细胞的作用并不清楚，但是MARCH1在调节内源性和外源性抗原提呈途径之间是有重要地位的。IL-10对APC的免疫抑制机制主要是通过调节共刺激分子（CD80、CD86）、MHC-Ⅱ表达和白细胞介素-12（IL-12）的产生来发挥作用的［23］。IL-10不仅降低APC抗原提呈的效能，而且可以提高肿瘤细胞的存活率。早期研究发现IL-10可以增加MHC-Ⅱ的表面表达，后来研究证明在单核细胞中IL-10的免疫抑制作用部分是通过上调MARCH1的mRNA表达水平来介导的，进而导致MHC-Ⅱ分子的泛素化和随后的降解［24］。

除了MHC-Ⅱ之外，MARCH1对CD86也有调节作用。CD86是APC表面的一种共刺激分子，CD86与T细胞表面的共刺激分子CD28接合，从而为T细胞提供共刺激信号，使T细胞易于激活。研究发现，MARCH1缺陷型小鼠的DC表达CD86的水平显著升高，提示MARCH1在CD86的调控中发挥作用［25］。缺乏MARCH1表达的DC在静息状态下表达的CD86明显升高，这说明DC中MARCH1介导的泛素化对抑制CD86的表达有重要作用，同时这些DC在静息状态下会呈现抗原提呈的状态，这些抗原可能被T细胞识别，然后导致自我反应性的T细胞活化。所以DC通过表达MARCH1抑制CD86的表达来控制不必要的、可能有害的T细胞活化［26］。DC受到脂多糖（LPS）刺激后会产生IL-10，同时DC暴露于IL-10的环境下会下调CD86的表达，所以DC产生IL-10通过自分泌的方式抑制了LPS诱导的CD86的增加，从而防止过量的CD86表达［26］。DC自分泌IL-10抵消了LPS诱导的MARCH1表达下调，潜在的机制是IL-10可能抑制LPS信号传导，从而下调DC中MARCH1的表达，也可能IL-10独立于LPS信号传导。总之，MARCH1介导的泛素化在调节CD86对自分泌IL-10的反应中起到至关重要的作用。单核细胞在IL-10的刺激下，MARCH1的表达水平显著上调，与CD86表达水平成反比。在泛素化结构上，与MHC-Ⅱ泛素化不同，MARCH1与CD86相互作用是通过蛋白的跨膜结构域介导的，CD86是胞质尾部中多个赖氨酸残基都可被泛素化［27］。可见与MHC-Ⅱ部分相同的是，MARCH1也通过对CD86的泛素化调节抗原提呈功能。

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）蛋白是一种能够识别不同病原体的同型和异型二聚体的跨膜蛋白家族［28］，TLR激活能最终导致NF-κB通路活化，产生很多促炎因子，例如白细胞介素6-（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），另外它还能诱导Ⅰ型干扰素的产生，因此TLR在针对病原体的先天免疫中有重要作用［29］。TLR受到Toll相互作用蛋白（Toll-interacting protein，Tollip）的负向调控［30］，Tollip与TLR结合抑制NF-κB的激活，减弱信号传导，同时MHC-Ⅱ与TLR之间存在相互作用。Tollip会参与MHC-Ⅱ的成熟和运输，还发现Tollip会大大降低MARCH1的表达水平，提示Tollip与MARCH1可能竞争结合MHC-Ⅱ［31］。研究发现MARCH1敲除小鼠的DC，会使促炎因子IL-6、IL-12和TNF-α减少，这表明MARCH1可能参与了TLR信号途径［25］，其实这种作用还是基于MARCH1对MHC-Ⅱ的泛素化。

除此之外，MARCH1也参与其他分子的调控机制。CD83在成熟的DC中表达最高，CD83的跨膜结构域可以抑制MARCH1的活性，促进DC上MHC-Ⅱ和CD86的表达，并对抗IL-10对MARCH1的诱导作用，故CD83是MARCH1的拮抗因子［32-34］。CD98促进淋巴细胞扩增，其在淋巴瘤和白血病中表达升高，是这些疾病的潜在治疗靶标［35］。MARCH1的异位表达会使CD98泛素化进而溶酶体降解。研究发现，使用无催化活性的MARCH1或构建抗泛素化的CD98突变体来阻止泛素化可防止MARCH1诱导的CD98下调。而且体外实验证实抗泛素化的CD98 T细胞表现出抗原驱动的增殖和克隆扩增能力增强。因此，MARCH1泛素化CD98提供了一种抑制细胞增殖的新途径［36］。调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）对维持免疫稳态和预防自身免疫很关键，DC是Tregs发挥抑制作用的目标之一。适应性调节T细胞产生的IL-10介导了DCMARCH1的表达升高，对MHC-Ⅱ和CD86泛素化进而表达降低，除此之外IL-10会使CD83的表达降低，抵消一部分CD83对MARCH1的拮抗作用［34，37］。因此，Tregs对DC的调控机制也有MARCH1的参与。

4 MARCH1与疾病

研究发现，MARCH1在抑制先天性炎症方面发挥作用。MARCH1敲除的小鼠更易受到LPS诱导的内毒素性休克影响，这种现象与促炎性因子的全身增加有关，但并未观察到IL-10的表达变化，即MARCH1不会改变IL-10信号传导，也不会响应LPS刺激产生TNF-α。所以MARCH1调节先天性的免疫应答的作用独立于IL-10/MHC-Ⅱ通路，可能机制是促进促炎性Ly6CHi单核细胞向其抗炎性Ly6C+/-表型的转变和调节单核细胞与多型核中性粒细胞在骨髓释放和定位中的作用［4］。还有研究表明MARCH1在过敏性哮喘中也发挥作用，MARCH1敲除小鼠诱导的急性过敏性哮喘模型中，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增多，但会降低气道高反应性以及IL-6、IL-10和IL-13的产生。这项研究表明，MARCH1在变应性哮喘中并不是通过泛素化MHC-Ⅱ和CD86调节过敏性反应，而是通过促进Th2细胞因子的分泌进而促进过敏性炎症的发展，还通过增强肺泡巨噬细胞和淋巴细胞补体受体CD88的表达来促进变态反应，MARCH1对肺中性粒细胞炎症起到保护作用［5］。除此之外，并没有发现MARCH1在其他炎症性疾病中的报道，因此MARCH1与炎症的机制研究更需要进一步探讨。

MODS是由于创伤、休克、感染或者炎症引起的系统性炎性反应失去控制导致的多系统器官急性进行性的功能障碍，病死率非常高。MODS是一种免疫相关性疾病，DC与MODS的发生发展密切相关，并且在MODS的免疫系统功能障碍中起到重要作用［38-39］。MARCH1在MODS病程第1天显著降低，同时MHC-Ⅱ表达升高，后期MARCH1表达升高，MHC-Ⅱ表达降低，与病程前期趋势相反［6］。因此，MODS早期阶段MARCH1介导的MHC-Ⅱ泛素化可能改变了DC的免疫学活性，从而影响了MODS的病理生理进展，MARCH1可能是治疗MODS的新靶点，可见E3在MODS的病程进展中起到重要作用。

前期研究发现MARCH1作为一种E3在免疫系统中发挥了非常重要的作用，但是其在肿瘤的研究非常少，但近年来人们逐渐发现MARCH1在肿瘤中似乎也发挥相应促癌或抑癌作用。Meng等［7］首先发现MARCH1在卵巢癌中作为一种促癌蛋白促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，机制研究提示MARCH1通过NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路参与肿瘤的恶性生物学行为。该研究为评估卵巢癌患者的转移预后奠定了理论基础，也为卵巢癌的治疗提供了新的靶标。Xie等［8］发现MARCH1在肝癌组织和细胞中高表达，也会参与肝癌的增殖和转移等恶性生物学行为，同时抗肿瘤药物吡柔比星在蛋白水平抑制MARCH1的表达，一种从天然新型菌株里分离出来的secalonic acid-F（SAF）可以通过靶向MARCH1来抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡［40］。上述研究发现MARCH1可能是潜在的一个治疗肝癌的靶标，SAF也是一种待开发的治疗肝癌的新药。在以上两种恶性肿瘤中，MARCH1极可能是作为一种癌基因发挥作用，但是具体的促癌机制并未研究明确。鉴于以前MARCH1的研究主要是通过泛素化作用参与APC的抗原提呈，在肿瘤微环境下，MARCH1高表达进而泛素化APC上的MHC-Ⅱ和CD86，使其降解，APC无法发挥抗原提呈功能，即无法识别和呈递肿瘤细胞抗原，T细胞也就无法发挥杀伤作用，肿瘤细胞逃脱免疫系统的识别和杀伤，在体内存活和增殖。最新研究发现在膀胱癌中［9］，ciRs-6通过海绵吸附miR-653提高MARCH1的表达水平来抑制膀胱癌的生长，MARCH1在膀胱癌中发挥抑癌作用。综上所述，MARCH1在肿瘤中是发挥促癌还是抑癌作用并不是一致的，可能跟肿瘤异质性相关，具体的机制并未明确，可能与肿瘤微环境中的APC泛素化有关。

获得性免疫缺陷综合征又称艾滋病，是感染HIV引起的一种危害极大的传染病。最初发现MARCH8可以靶向HIV-1包膜糖蛋白，起到抗病毒的作用。MARCH1与MARCH8结构相似，最新研究报道MARCH1以剂量依赖的方式抑制病毒活性，其中RING-CH结构对MARCH1抑制病毒的活性很重要，MARCH1降低了病毒上清液中包膜蛋白的水平，但是RING-CH突变体并无变化［10］。该研究发现MARCH1降低细胞表面HIV-1包膜糖蛋白的表达，从而抑制包膜糖蛋白渗入病毒体的能力，降低病毒的感染率。可见MARCH1可能是治疗HIV的一个新靶点。

最新研究发现，在小鼠体内MARCH1通过泛素化下调细胞表面胰岛素受体的水平从而负调控胰岛素受体信号传导，这会损害糖尿病小鼠模型中的胰岛素敏感性［11］。实验发现，与MARCH1敲除的雄性小鼠和野生型小鼠相比，MARCH1敲除的雌性小鼠正常饲养时出现体质量增加和内脏脂肪堆积，这一现象提示MARCH1在脂质储存中发挥性别差异性的作用。Majdoubi等［41］研究发现，免疫细胞中MARCH1的缺乏会加剧肥胖诱导的胰岛素抵抗，在肥胖的MARCH1敲除小鼠中，内脏脂肪组织中的效应T细胞和记忆T细胞的比例更高。MARCH1对胰岛素抵抗和脂肪组织CD8+T细胞表型的影响的机制并不是通过MHC-Ⅱ的泛素化。该研究提示CD8+T细胞参与了脂肪组织炎症，MARCH1部分调控了这些细胞的代谢过程。这些研究表明，MARCH1在代谢领域有巨大研究前景。

5 问题与展望

泛素化已经成为体内调节各种生理过程的关键修饰方式，确定E3在各种疾病中的作用对我们进一步研究治疗方案至关重要。MARCH1主要在免疫细胞中表达，这使它能很好地调节免疫分子，参与免疫应答过程。尽管MARCH1在结构、功能和机理上的研究已经取得了相当大的进步，但是MARCH1在恶性肿瘤、糖尿病中的初步研究发现其不一定只局限在免疫系统中发挥作用，在其他疾病中并未得到充分研究。除了以上免疫分子，其他免疫受体是否受到MARCH1的调节？MARCH1蛋白的活性是否有上游信号的调控？不同疾病中MARCH1靶向的底物蛋白是否不同？我们对MARCH1与疾病的相关性仍知之甚少。随着生物分子学工具和转基因小鼠等模型的发展进步，对这些并未解决的问题进一步研究有助于我们清晰理解MARCH1在生理和病理过程中的作用机制，也为临床疾病的治疗提供新的药物靶标。