慢性乙型肝炎患者血清病毒RNA 的临床意义

王传敏 孟忠吉 陈悦

十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)感染科，湖北十堰442000

慢性乙型肝炎（CHB）是影响我国全民健康的重大传染性疾病。 目前，HBV DNA 病毒载量检测是唯一被许可的实验室指标，用于监测外周血循环病毒颗粒数量，从而反映了肝脏内病毒产生的活动性。 核苷（酸）类似物（NAs）广泛用于治疗CHB， 通过抑制病毒的逆转录和DNA 合成发挥抗病毒作用，但其不能直接靶向作用于HBV 复制的模板——cccDNA，并且可能需要终生用药以抑制cccDNA 的回补。

cccDNA 定量检测虽然是临床评价治疗效果和预测停药终点的重要指标，但因需要肝组织穿刺活检具有一定的局限性，因此无法在临床普遍开展。 血清HBV RNA 作为cccDNA的转录产物[1]，是反映其活性的理想血清学替代指标，它在血液中的含量可作为反映HBV 转录活性和判断药物疗效更直接、更可靠的指标[2]。HBV 前基因组RNA （pgRNA） 可存在于成熟病毒颗粒的核衣壳内，这种病毒颗粒被称为“HBV RNA病毒样颗粒”，在血液中可以检测到全长或剪接的pgRNA。最近的研究表明，HBV pgRNA 作为一种反映肝内HBV cccDNA 存在状态和转录水平的新型血清学标志物， 在CHB治疗进展方面具有重要的临床意义[3-4]。 因此，本综述将总结血清中HBV pgRNA 的来源、组成、特征及其在乙型肝炎临床管理中的意义。

一、血清HBV pgRNA 来源与组成

1.全长HBV pgRNA 的来源与组成

pgRNA 是HBV 逆转录的模板，HBV 基因组的复制需要pgRNA 与DNA 聚合酶相互作用以进行逆转录， 逆转录发生在细胞质的病毒衣壳中。 pgRNA 与DNA 聚合酶结合后被包装到由240 个核心蛋白组成的核衣壳中。 pgRNA 中的3 个RGAG 基序与磷酸化的衣壳蛋白的羧基端相互作用来促进核衣壳组装[5]。 末端蛋白、 间隔区和逆转录酶区中含有与HBV pgRNA5' 端茎环结构（Hε）相互作用、转录启动和包装相关的氨基酸[6]。pgRNA 5' 端的“帽子”结构对于pgRNA 包装也很重要，因为5' 端“帽子”和Hε 之间的距离决定了pgRNA可否被包装[7]。

在逆转录过程中，DNA 聚合酶中的RNaseH 会水解RNA模板，但保留5' 端寡核苷酸，随后残存的RNA 寡核苷酸置换到直接重复序列2（DR2），以启动正链合成[8]。 因此，基于pgRNA 的HBV 细胞内复制是一个多步骤过程，包括DNA 聚合酶的结合、转录启动、包装、DNA 合成和RNA 水解。该过程需要病毒内部和病毒-宿主之间相互协调配合， 病毒或宿主因子上的任何错误均可能影响pgRNA 的稳定性和功能。

NAs 终止HBV DNA 延伸可以发生在核衣壳成熟的不同阶段。 当恩替卡韦、阿德福韦或替诺福韦等NAs 在转录启动或负链合成的早期终止DNA 延长时，RNaseH 功能可能不会被激活，核衣壳中的pgRNA 可能会保留完整的poly（A）“尾巴”， 或者仅3' 端被略微缩短但仍保有相对较长的RNA 链。虽然据报道只有包裹了完整的负链DNA 的核衣壳才能被表面蛋白包装，但仍有证据表明血液中病毒样颗粒内可以检测到全长的pgRNA[1,3]。

2.剪接HBV pgRNA（sp-pgRNA）的来源与组成

最初，人们认为在HBV 感染的细胞中HBV RNA 剪接并不常见，但研究发现，HBV pgRNA 确实具有多个剪接供体和受体位点， 并且在包括土拨鼠肝炎病毒和鸭HBV 在内的嗜肝DNA 病毒感染的组织中很容易检测到剪接产物[9]。 实际上，目前已经从组织培养和CHB 患者中鉴定出18 个以上的sppgRNA[10]。

在转录HBV pgRNA 活跃的细胞中， sp-pgRNA 占总pgRNA 的10%～30%。pgRNA 的剪接活性受HBV 转录后调控元件 （PRE） 的调控，PRE 的SLα 茎环区域被认为对HBV RNA 剪接调控很重要。 另外，在pgRNA 的第2951 位和3163 位核苷酸之间还存有一个内含子剪接沉默子（ISS），删除ISS 显著促进了sp-pgRNA 的产生[11]。人们还发现与宿主剪接相关的因子如La 蛋白和PSF 能刺激HepG2 和Huh7 细胞中sp-pgRNA 的表达[12]。 据报道，当核心蛋白存在于CHB患者的肝细胞核时，sp-pgRNA 与全长pgRNA 的比例明显增高[13]。sp-pgRNA 在HBV 生命周期、感染持续性和发病机制中起的作用仍有待阐明，尚未排除sp-pgRNA 调节HBV 复制的可能性。

大 多 数sp-pgRNA 保 持 完 整 的5' 端H ε 结 构、X 蛋 白ORF 和直接重复序列， 可以被包装到衣壳中。 剪接的HBV RNA 通常在包膜蛋白（LHBs 的PreS1，MHBs/SHBs 的PreS2/S） 和Pol 聚合酶的合成上有缺陷，但是HBc （衣壳蛋白） 和HBV X 蛋白ORF 可能很大程度上保持不变。因此，sp-pgRNA不可能自动复制和分泌含剪切的HBV DNA （spHBV） 的颗粒。 spHBV 颗粒的产生需要在同一细胞中pgRNA 和亚基因组RNA 翻译出的Pol 和包膜蛋白进行反式补偿。反式提供的聚合酶能有效地对sp-pgRNA 进行转录启动和负链合成。有趣的是，在瞬时转染中，spHBV 颗粒中的DNA 结构主要为双线性形式，而不是疏松环状DNA[14]。

二、 血清HBV pgRNA 的临床意义

1.全长HBV pgRNA 的临床意义

在20 多年前就有报道在CHB 患者血液中检测到HBV RNA，这些HBV RNA 来自吸附在外周血单核细胞上的HBV颗粒[15]。据估计，在CHB 患者体内，外周血单核细胞携带的病毒颗粒量大约是血清中病毒载量的0.5%，通过蔗糖密度梯度离心和抗体沉淀，发现血清中的pgRNA 包含在HBV 病毒样颗粒中[16]。最近发现CHB 患者血清中病毒样颗粒只能检测到微量的pgRNA，pgRNA 主要来自于裸露的核衣壳[1-2]。 因此，血清HBV RNA 的来源值得进一步研究。

当NAs 阻断病毒的逆转录和rcDNA 的合成时， 会导致血循环中病毒DNA 相对快速减少， 但不会导致包装的pgRNA 迅速减少。 作用于病毒DNA 合成之前的药物如核衣壳抑制剂可降低循环pgRNA 的水平。 因此， 血清HBVpgRNA 水平的检测对HBV 感染的辅助诊断和NAs 的抗病毒疗效监测及停药预测有着重要意义[17]。 越来越多的证据表明，血清pgRNA 的定量有助于确定CHB 患者终止NAs 治疗是否安全。 研究发现，NAs 治疗12 周时HBV RNA 水平与停药后24 周内HBV DNA 反弹率显著相关，12 周时血清HBV RNA 水平可作为一独立影响因素来预测初始的病毒学应答;NAs 治疗结束时如果pgRNA 仍能检测到，停药后24 周则很可能发生病毒学复发。 HBV pgRNA 的状态可以反映CHB 患者接受NAs 抗病毒治疗的长期预后，CHB 患者接受抗病毒治疗48 周后HBV pgRNA 仍为阳性的患者HBeAg 转阴失败的概率更高， 这些患者也需要更长的时间实现HBeAg 转阴及HBV DNA 转阴[18]。 另外，在一项考察559 例HBeAg 阳性的CHB 患者NAs 治疗效果的研究中， 130 例患者经2年NAs 治疗后血清HBV DNA＜20 IU/mL，且HBeAg 转阴。停药后4年内，46.5%的患者HBV DNA 反弹至＞2000 IU/mL。但如果停药时患者血清HBV RNA 是阴性， 只有21.2%患者有病毒学指标的反弹[19]。 因此，检测血清中HBV RNA 水平可作为预测NAs 安全停药的指标[5，20-21]。 pgRNA 的定量也可以用于监测NAs 耐药突变的出现[22]。当NAs 与IFN-α 一起使用时，HBV RNA 在治疗早期的明显下降预示NAs 和IFN-α 联合治疗的反应较好， 而血清中病毒DNA 的水平无法揭示患者 是 否 会 对 治 疗 产 生 应 答[16]。 van Bömmel 等[23]应 用NAs 和IFN-α 抗病毒治疗3 个月后HBV RNA 降低则HBeAg 血清学转化率更高， 而高水平HBV RNA 患者停止抗病毒治疗易发生病毒反弹。

通过随访接受恩替卡韦治疗的患者，Wang 等[4]观察到循环中的HBV RNA 在表达水平和序列变异方面反映了肝脏中病毒RNA 的状态：他们对血清中的HBV RNA，以及配对的肝脏中病毒RNA 进行了深度测序，发现血清HBV RNA 在遗传学上与肝内HBV RNA 同源， 血清HBV RNA 水平反映了肝内HBV RNA 的量以及亚型的组成。 此外， 还发现血清HBV RNA 与肝组织学改变有关， 血清HBV RNA 水平以2.45 lg 拷贝/mL 为临界值将肝组织轻度炎症纤维化（Metavir评分＜2）与重度肝组织病理学区分开。 然而，接受恩替卡韦治疗的CHB 患者和HBV 感染的人源化小鼠， 血清病毒RNA和cccDNA 之间的定量相关性无法建立， 这表明血清HBV RNA 的水平只反映肝脏中cccDNA 的转录概况。

2.sp-pgRNA 的临床意义

血清中spHBV 颗粒的剪接模式根据HBV 基因型和疾病分期而有所不同[10，24]。 在由急性感染发展为慢性感染的6例乙型肝炎患者均检测到spHBV，但在完全康复的患者中只有9%被检测到[25]。 在体外和体内实验中，通过剪接供体和受体位点突变阻遏spHBV 产生， 可重新建立HBV 对IFN-ɑ 的敏感性，在乙型肝炎患者血液中spHBV 含量与对IFN-ɑ 治疗的反应性成反比[10]。 此外，对无症状携带者、慢性肝炎和肝硬化患者血清中病毒DNA 的测序分析表明，Pre-S1 第57～119位氨基酸之间的缺失在肝硬化患者更常见[26]。Redelsperger 等[27]评估了56 例CHB 患者和273 例急性乙型肝炎患者的spHBV DNA 水平与疾病状况之间的关系， 结果显示在肝坏死和纤维化的患者中，spHBV 相对于全长HBV 的比例变得更高。 这些结果表明，肝细胞在病毒复制和免疫反应所致的异常生理环境中可能倾向产生剪接的RNA。 此外，从多个原发性肝癌组织中分离到的剪接pgRNA 也显示spHBV DNA可能是病毒基因组整合的来源[28]。 与CHB 患者相比，原发性肝癌患者spHBV 颗粒的含量更高[29]，它可能作为肝癌发生的标志物[30]。

三、结语

目前研究显示， 血清中的HBV pgRNA 既可以来自病毒颗粒又可以来自裸露的核衣壳；在未接受过NAs 治疗的患者中，HBV RNA 水平低于HBV DNA；但在NAs 治疗期间，病毒DNA 与RNA 的比例可以颠倒。 血清中HBV pgRNA 的表达水平和序列特征可以反映肝脏中cccDNA 的转录活性、表明耐药突变体的出现并预测治疗结果。 接受NAs 治疗的患者，血清剪接pgRNA 相对于spHBV DNA 的比例会增加，而pgRNA 与病毒DNA 的比例也会增加。 另外， 从血清HBV RNA 深度测序获得的数据可能比HBcrAg 定量检测更敏感，更能反映cccDNA 转录活性的动态变化。 因此， 在乙型肝炎的临床管理中， 对血清HBV RNA 进行测定可用于预测抗病毒疗效及预后判断。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突