乙型肝炎病毒核衣壳组装调节剂最新进展

莫佳妮 颜学兵

徐州医科大学附属医院感染性疾病科，江苏徐州221002

HBV 感染及其相关肝脏疾病的治疗一直是热点研究领域， 现有的抗HBV 治疗药物主要有核苷类似物 （NAs）和IFN。 恩替卡韦和替诺福韦等NAs 以HBV DNA 聚合酶为靶点抑制病毒复制， 但其不能减少共价闭合环状DNA（cccDNA）的形成，而cccDNA 正是病毒持久存在的原因[1-2]。IFN 治疗也仅对一小部分患者有效， 而且存在一定的不良反应[3-5]。 目前有许多在研的抗HBV 药物，其中核衣壳组装调节剂（CAMs）能破坏前基因组RNA（pgRNA）的封装，导致核衣壳解体，从而影响HBV 复制的多个步骤，同时减少cccDNA库[6]。 本文对各类CAMs 的发展及其与HBV 核心蛋白之间相互作用的研究进展进行综述。

一、核衣壳组装作为药物靶点的可行性

目前在研的抗HBV 药物主要有以宿主蛋白为靶点的宿主靶向药物（HTA）和针对HBV 复制靶点的直接抗病毒药物（DAAs）。 HTA 可直接作用于病毒因子和/或宿主免疫系统，如热休克蛋白90（Hsp90）对HBV 衣壳的形成和稳定有重要影响，抑制或下调Hsp90 可降低HBV 在HepG2.2.15 细胞中的复制[7]。 在研的DAAs 主要包括HBV 入侵抑制剂、HBsAg释放抑制剂、靶向作用于cccDNA 抑制剂、HBV 转录抑制剂、聚合酶抑制剂、核衣壳组装和pgRNA 包装抑制剂。

核衣壳蛋白在HBV 基因组包装、逆转录、胞内运输和维持HBV 复制循环等方面发挥作用[8]。 在HBV 组装过程中，核心蛋白同源二聚体将HBV pgRNA 和聚合酶包裹， 形成具有生物活性HBV 的核衣壳。 有研究使用电荷检测质谱法发现，在HBV 组装过程中早期产生的衣壳颗粒是有缺陷和过度生长的，但是经过一段时间后HBV 会进行自我校正，表明结束装配只是HBV 复制过程中特有阶段，这与先前认为HBV 复制组装过程会产生完美二十面体核衣壳的假设相反[9]。 值得注意的是，该研究是体外研究，并且是在没有包装材料的截短体核衣壳情况下进行的，因此，还需要更多的实验去证实。尽管如此， 核衣壳组装和校正过程为HBV 感染治疗提供了一个有吸引力的方向。 小分子疗法能使HBV 的核心蛋白不稳定，增加核衣壳组装率，形成畸变的或空的、无功能的核衣壳粒子[10]。

二、在研的CAMs 分类

目前在研CAMs 可以大致分为5 类： 苯丙烯酰胺（PPAs）、异芳基二氢嘧啶（HAPs）、磺酰苯甲酰胺（SBAs）、氨基酰吡咯酰胺（SPAs）和乙二氢吡咯酰胺（GLPs）。 CAMs 使cccDNA 暴露而便于其被降解酶降解， 以阻止cccDNA 的形成，目前推测比现有抗HBV 的NAs 更难出现耐药[11]。 近期，CAMs 造成核衣壳错误组装的能力也被证明[12]。

1.PPAs 和HAPs

PPAs 和HAPs 是目前被研究较多的CAMs，两者都结合在HBV 核心蛋白亚基C-末端附近的二聚体-二聚体界面形成的相同疏水腔上，这导致了大规模的变构构象变化，从而破坏了HBV 核心蛋白的稳定性并增加了核衣壳的装配率。

PPAs 可以作为一种分子黏合剂以促进核衣壳组装速度[13]，因其高速的组装，不能包裹pgRNA，从而不能形成核衣壳和pgRNA 的复合物，最终导致空衣壳的产生。PPAs 抑制野生类型和拉米夫定耐药HBV株[化合物AT-61 及其优化结构AT-130抑制病毒复制的50%最大效应浓度（EC50）分别是1200 和130 nmol][14]，但是仍然需要临床试验证实其作用。 HAPs 能形成异常的、无功能的衣壳颗粒[15]，因为它们干扰了病毒基因组末端的直接相互作用，并改变了核衣壳蛋白二聚体在第4 级水平上的接触几何结构。 对HAPs 的不断优化，现已产生了许多有效的类似物， 例如BAY41-4109 （EC50 =50 nmol）和GLS-4（EC50 =12 nmol）。

2.苯甲酰胺（BAs）和SBAs

BAs 是在Blumberg 研究所通过26900 个高通量筛选的结果而被发现的化合物。通过对2017年初始BAs 的优化，产生了BA-38017（EC50=160 nmol/L），它能抑制HBV 复制，并诱导空衣壳的形成[16]。 此外，2013年首次披露的早期SBAs-DVR-23 ，能抑制DNA 合成之前的病毒复制步骤，以形成类似于PPAs 的空衣壳。 Blumberg 研究所探索了SBAs 支架的环A 和环B 上的取代基[17]。几种化合物对HepDES19 细胞的EC50均低于1 μmol/L。

Emory 大学研究团队对SBAs 进行进一步优化， 分子模型显示取代氨基的位置处在狭窄的、疏水的、暴露于溶剂的通道中， 该通道不仅与HBV 核衣壳蛋白形成特定的相互作用，并且几个小的疏水取代均具有良好的耐受性。 在取代的氨基中，环烷基团的结果最好；苄基磺酰胺、氨基酸和二磺酰胺取代的化合物由于空间位阻冲突而效力小；原始苯胺部分与取代苄胺的交换导致活性丧失；N-芳基氨基是一个重要的基团， 颠倒酰胺的NH 和C=O 官能团的位置，N-甲基化和磺酰基取代显著降低了活性；同样，刚性双环衍生物也没有显示出活性。 然而，颠倒磺酰胺基的NH 和SO2的位置，在很大程度上保留了效力[18]。

Janssen 公司报告了他们研究SBA 的抗HBV 活性，在HepG2.2.15 细胞中EC50 值为59 μmol/L～50 nmol/L[19]，在SBAs中观察到低代谢稳定性（暴露于人肝微粒体15 min 后残留＜10%）和低溶解性[20]。然而，在环A 上引入4-氟取代基，在环B上引入支链氨基烷基或四氢呋喃后，增强了代谢稳定性。 优化后的化合物显示出中等的血浆清除率，良好的口服生物利用度， 并有望在具有人源化肝脏的基因D 型HBV 感染嵌合小鼠体内减少cccDNA。 Janssen 公司还报告了SBAs 的生物学特征， 揭示了它们的化合物具有双重作用模式， 即干扰HBV 衣壳的组装和拆卸， 并阻止新生肝细胞获得病毒遗传物质[21]。

3.SPAs

Janssen 公司的研究还扩展到呋喃、吡咯，吡啶和苯基环B 的噻吩取代。 在磺胺类药物中， 鉴定出几种EC50 值达到32 nmol/L 的强效化合物[22]。 进一步的研究表明，将环B 转化为吡咯环比氨磺酰噻吩酰胺的效力提高了10 倍以上， 并建立了一类新型抑制剂， 即SPAs。 除了导致总病毒RNA 和pgRNA 水平下降外，SPAs 还调节HBV 生命周期的多个步骤，包括HBeAg 生成[23]。 在2017年，Vendeville 等[24]报道新发现的环化SPAs 能维持低纳米摩尔抗病毒活性。

4.GLPs

GLPs 能破坏已形成的衣壳， 是最新的一类高效CAMs，由SPAs 中磺酰胺基被乙二醛取代而产生，有报道发现GLP-26 的EC50 为0.1～0.9 nmol/L[25]。 GLP-26 具有良好的代谢 稳定性，在狗和人血浆中半衰期＞24 h，在高脂血症中的半衰期为7.6 h，GLP-26 和恩替卡韦的双重联合具有很强的协同抗病毒作用[25]。 Gilead 公司专利申请描述了用2，3-二氢-1H-吡咯嗪和1，1a，6，6a-四氢环丙烷[b]吡咯烷取代吡咯的探索[26]。这两个系列均表现出低纳米摩尔HBV 抑制作用， 半衰期范围为4～16 h 不等。 与具有1-甲基取代的3，3-二氟环丁氮烷环的结构相比（EC50 = 60～100 nmol/L），引入3，3-二氟环丁氮烷环上的1，2，3-三氮唑支链导致效价增加5 倍（EC50 =2～4 mmol/L）。

三、新型CAMs

除SBAs、SPAs 和GLPs 外，已出现了结构新颖的CAMs。Assembly Biosciences 公司提交了新型二氢二苯并 [b，f][3，6]噻嗪-8-羧酰胺的专利申请[27]，该系列在10 μmol/L 处所测得cccDNA 病毒载量的百分比表明其活性良好。此外，Hoffmann-La Roche 公司公布了关于三环4-吡啶酮-3-羧酸的专利申请[28]，指出其EC50 值处于中纳米摩尔浓度。 Janssen 公司的研究人员目前正在开发N-苯基羧酰胺衍生物，这些衍生物也具有针对cccDNA 的中纳米摩尔到低纳米摩尔EC50 值[29]。

四、HBV 核心蛋白突变体对CAMs 的抗性

HBV 核心蛋白及其组装成核衣壳已成为CAMs 作为抗病毒药物的重要靶点。 自然产生的T109 突变体已被证明对部分CAMs 具有抗性，Ruan 等[30]发现T109 突变体（T109M，T109I 和T109S）导致核衣壳稳定性变化和对弱CAMs 出现抗性， 通过从微秒长的全原子分子动力学模拟中挖掘数据发现，可以阻止核衣壳进入CAMs 结合位点。 Klumpp 等[31]比较NVR010-001-E2 和BAY 41-4109 对HBV 核心蛋白氨基酸变异株与野生型病毒复制的抗病毒活性，发现含有核心Y118F变异体的HBV 基因组不太容易受到两种核心抑制剂的抑制。

五、结语

CAMs 的研究中，SPAs 和GLPs 显示出良好的活性，但目前所有的细胞培养模型只能产生极低数量的cccDNA[32]，将来有待进行更好的药物有效性和安全性研究。 随着针对核衣壳组装过程的新型CAMs 的出现，可以证明这些调节剂是干扰实际组装还是干扰核衣壳的自校正过程。 将CAMs 与现有的抗病毒药物结合使用， 或许可以形成一种阻断cccDNA 生成以达到临床治愈的串联机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突