呼吸道合胞病毒不同型别病毒株与疾病严重程度的相关性研究进展

2021-04-17任康轶综述任洛刘恩梅审校

儿科药学杂志 2021年6期

任康轶综述，任洛，刘恩梅审校

(重庆医科大学附属儿童医院，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿童感染免疫重庆市重点实验室，重庆 400014)

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起全球婴幼儿严重呼吸道感染最主要的病原，有研究统计，2015年全球约 3 310 万例婴幼儿因RSV患下呼吸道感染，约320万例患儿住院治疗，其中约5.9万例<5岁的患儿死亡[1]。感染RSV后可致鼻炎、毛细支气管炎及肺炎等，严重时可引起呼吸衰竭。同时，婴儿时期感染RSV与学龄期持续喘息、罹患哮喘、肺功能减退有关[2-3]。RSV感染后机体并不能提供长效的保护性免疫，再感染可发生于整个生命过程中[4]。国际指南指出，对于RSV感染高危患儿可给予帕丽珠单抗预防，然而对于大部分患儿来说，至今还没有上市的疫苗，因此疫苗研发和对因治疗迫在眉睫。

在RSV感染中，多种因素可影响病情严重程度，如环境因素、宿主因素、病毒因素等。病毒因素与严重程度的关系，对未来疫苗研发及治疗有重大指导意义。本文将从RSV分子特征、流行情况、病毒类型与疾病严重度的关系、导致严重度不同的原因、基因变异对RSV预防与治疗的影响6方面展开讨论。

1 RSV分子特征

RSV是一种非节段性负义单链的RNA病毒，属副黏病毒科肺炎病毒属，分为A、B两种抗原亚型，亦可根据G基因变异性将每种亚型进一步分为多种基因型。G蛋白和F蛋白是RSV表面两种极为重要的糖蛋白，不仅在RSV致病过程中起着关键作用，又可引起宿主抗体的中和反应[5]，因而在疫苗研究中有着重要意义。

G蛋白主要介导病毒对宿主细胞的黏附。它是一种Ⅱ类跨膜蛋白，包含约300个氨基酸，其胞外域由第一高变区、中央保守区和第二高变区(HVR2)组成。G基因在RSV基因组中变异度最大(变异度为53%)[6]，靠近肽链C端的HVR2含有丰富的糖基团，可能改变RSV抗原性，与免疫逃逸相关，增加了反复RSV感染甚至大规模暴发流行的风险[7]。

F蛋白主要介导病毒与宿主上皮细胞膜融合，是病毒入胞的关键。F蛋白首先合成前体F0，再由furin样蛋白酶水解生成F1和F2，二者通过二硫键连接形成三聚体，即不稳定的融合前构象(prefusion conformation，pre-F)；pre-F与细胞表面受体结合后发生一系列的结构改变，从而导致细胞融合、病毒入胞，此时pre-F形成稳定的融合后构象(postfusion conformation，post-F)。同时，F蛋白表面有多个中和抗体的结合位点，可诱发宿主不同程度的中和反应，有利于病毒的清除。

2 RSV流行情况

RSV在全球范围广泛流行，在温带地区RSV主要在冬春季节暴发；然而在寒带地区，几乎全年都可检出RSV。A、B两种亚型常共同流行，每年的相对比例不同，总体上A亚型占主导的流行季更多。RSV在中国地区以A、B亚型各流行2年的模式交替流行，可能与人群适应性免疫有关，但无确切证据。目前已报道的A亚型基因型主要有GA1-GA7、SAA1、NA1-4、CB-A和ON1。B亚型基因型有GB1-4、BA1-12、SAB1-4、URU1-2和CB-B。不同基因型可在同一地区同时流行，但各地区主导基因型基本一致。RSV-AON1基因型于2010年在加拿大安大略省首次被发现[8]，其G基因存在72个核苷酸重复片段插入，随后南非、马来西亚、德国等地也相继报道，ON1基因型在全球迅速传播，取代了此前A亚型的主导基因型NA1。而B亚型流行的主要基因型为BA基因型，1999年首次在阿根廷被检测到[9]，与ON1基因型类似，BA基因型G基因包含60个重复核苷酸片段，其在进化过程中又可以分为许多分支，大部分地区以BA9基因型分支最为流行。

3 RSV型别与疾病严重程度的关系

多年来，不少学者分析了RSV不同亚型、基因型与病情严重程度的关系，但结论存在很大的差异。

3.1 不同亚型与疾病严重程度的关系

迄今为止，大部分研究提示感染RSV-A的患儿病情重于RSV-B。2013年美国一项大型多中心前瞻性研究报道，在RSV单一病毒感染患儿中，RSV-A感染患儿住院率及转入ICU比例均较RSV-B高[10]。McConnochie K M等[11]发现RSV-A感染的患儿中需要机械通气的比例较RSV-B高；Walsh E E等[12]通过前瞻性研究分析发现，RSV-A感染是患儿病情严重的独立危险因素之一。Papadopoulos N G等[13]基于呼吸频率、心率、血氧饱和度、有无喘息及喂养困难等方面对患儿临床表现评分发现，RSV-A感染患儿得分更高(病情更重)，然而住院时间及转入ICU比例在两种亚型间差异无统计学意义；Hornsleth A等[14]则认为RSV-B引起患儿病情更重，同时他还发现临床表现与年龄相关：0～5月龄的患儿中，RSV-B阳性患儿住院时间更长；0～2岁患儿中，RSV-B阳性患儿呼吸频率和胸部影像学表现更重。

还有大量研究并未发现两种亚型间病情的差异。Fodha I等[15]认为RSV导致的病情严重度与亚型没有关联，而更可能是宿主与病毒之间相互作用的结果。近期一项研究[16]纳入了729例广东地区因呼吸道疾病住院的患儿，发现RSV-A阳性的患儿患毛细支气管炎比例更高，更易出现呼吸困难、鼻炎及胃肠道症状，而寒颤、肌痛、乏力等流感样症状则与RSV-B相关。

3.2 不同基因型与疾病严重程度的关系

RSV分子流行病学研究报道已较多，但基因型与疾病严重程度的关系仍无定论。Martinello R等[17]研究了美国纽黑文2个流行季107例感染RSV的患儿，发现GA3基因型比GA2基因型及B亚型病情更重。另一项研究发现NA1基因型与BA基因型相比，有着更高的住院率、更重的临床表现及病毒载量。

随着RSV-AON1在全球范围内的广泛流行，许多学者分析了ON1基因型与其他基因型感染患儿的临床表现，结论亦不统一。Panayiotou C等[18]比较了GA1、ON1、BA三种基因型，发现ON1基因型感染后病情较另外两种基因型轻，BA基因型感染患儿吸氧比例更高；另一些研究也认为ON1基因型毒力更弱。然而越南一项研究发现，在ON1基因型开始流行后，因RSV感染引起的急性呼吸道感染住院率显著升高，且ON1基因型引起下呼吸道感染、肺部实变的比例均高于NA1基因型[19]。

Midulla F等[20]研究了意大利2005-2017年因RSV感染引起急性毛细支气管炎住院的312例婴儿，发现前7个流行季均以NA1为主导基因型，2012年后则由ON1基因型主导，BA基因型在各流行季均有检出。该研究认为在3种基因型中，NA1基因型阳性的患儿病情更严重、年龄更小；BA基因型阳性的患儿比NA1基因型阳性的患儿嗜酸粒细胞数更高，哮喘家族史的比例也更高；ON1基因型的患儿病毒载量更高。Esposito S等[21]也得出类似结论。然而Yoshihara K等[19]发现ON1比NA1病情更严重。

3.3 不同病毒株引起的病情严重程度不同

RSV主要侵犯细支气管上皮，导致纤毛细胞的破坏、脱落；同时引起气道黏液分泌增多，形成黏液栓，导致气道狭窄，造成患儿呼吸困难。故RSV对纤毛细胞的破坏程度及黏液分泌程度可作为评估不同病毒株毒力的参考依据。Villenave R等[22]利用小儿高分化的原代支气管上皮细胞(WD-PBECs)比较了病毒株A2(GA1)和BT2a(GA5)的毒力，发现BT2a引起了更为明显的上皮细胞脱落和杯状细胞增生，在HAE培养基中，BT2a也较A2导致黏液分泌更多。A2、Long和Line19均是RSV的A亚型病毒株，三者之中Line19可引起明显的气道黏液分泌，且Krishnamoorthy N等[23]还发现，反复的Line 19感染可导致幼鼠已建立的卵白蛋白耐受被破坏。Stokes K L等[24]比较了2-20及3-12两株同为GA2基因型的RSV病毒株，发现2-20可引起小鼠气道更多的黏液分泌，呼吸困难表现更为严重。Levitz R等[25]分析了RSV-B亚型的临床株NH1125B及NH1067B对固有免疫的影响，发现前者可引起白细胞介素(IL)-6及CCL5分泌更多，而IL-6及CCL5被普遍认为在炎症反应中起重要作用，可激活机体固有免疫。不同病毒株引起的病情严重程度不同，不同病毒株与病情严重程度的关系有待进一步研究。

4 不同型别间严重程度不同的原因

已有大量研究比较RSV不同型别的病情严重度，但相关机制研究却寥寥无几。Wu W等[26]报道，RSV-A亚型与RSV-B亚型相比，可更强地激活NF-κB信号通路，进一步引发炎症及免疫调节反应，或可解释大部分A亚型严重度高于B亚型的现象。

Midulla F等[20]发现，ON1基因型感染患儿的RSV病毒载量远远高于NA1基因型和BA基因型，然而临床严重度却更低。而Kadji F M N等[27]研究发现，NA1基因型的病毒载量高于ON1基因型和BA9基因型，与更严重的病情呈正相关，故至今病毒载量与病情严重程度间的关系仍未明确。还有研究称，RSVBA型中重复序列改变了G蛋白的抗原特性，影响中和抗体的识别，还可通过增强G蛋白介导的病毒对宿主上皮细胞的黏附，更有利于病毒侵袭[28]。另一方面，重复序列的插入使G蛋白的O-糖基化位点增多，可能会影响G蛋白抗原表位的表达，有利于病毒免疫逃逸。

有研究表明，A2和Long感染后的BALB/c小鼠主要产生Th1类免疫反应，而Line19主要引发与IL-13相关的Th2类免疫反应，同时，IL-17和胸腺基质淋巴生成素(TSLP)作为Th2类反应的重要因子，在Line19引起小鼠黏液分泌中也发挥一定作用。有研究发现，Line19有独特的F基因序列，表达Line-19 F基因的A2病毒株A2-line19F能引起小鼠肺部IL-13的增高和黏液分泌，显示F基因可能在Line19致病机制中扮演重要角色[29]。Stokes K L等[30]报道，与Line 19相似，2-20导致的黏液分泌与IL-13相关，而在非黏液分泌型毒株3-12感染的小鼠体内检测到CD8 T细胞水平更高。Stokes K L等[30]还发现，当2-20的F蛋白与G蛋白同时表达时，融合活性较体外表达有所升高，提示在2-20致病过程中G蛋白与F蛋白之间可能存在相互作用，提高了F蛋白的融合活性。不可忽略的是，中性粒细胞也在RSV致病过程中发挥重要作用，它是TNF-α的主要来源，可导致上皮细胞破坏，促进气道gob-5、Muc5ac及黏液的分泌。在该研究中，2-20及A2-2-20F株与A2株相比均可引起小鼠感染后更高的中性粒细胞水平。

Levitz R等[25]研究发现，病毒株NH1067B的G基因中有60个碱基的重复及G蛋白第229位氨基酸替换，其M2-1蛋白第142位存在氨基酸替换，可在病毒复制早期抑制固有免疫，从而增强病毒的适应能力。

5 基因变异对RSV预防与治疗的影响

对于RSV感染的预防及治疗方向主要有疫苗、单克隆抗体和小分子化合物等，目标人群主要是小婴儿、孕妇及老人。Sande C J等[31]发现，几十年来，尽管RSV不断发生基因变异，但其引起的中和反应并无太大改变，故未来研发的疫苗可能在很长一段时间是有效的。同时Sande C J等[31]还发现在曾感染过A亚型或B亚型的受试者中，其发生同源性血清转换的能力远远高于异源性血清转换，此外，能同时呈递两种亚型抗原的疫苗可能更为有效。

针对F蛋白抗原表位Ø的抗体比帕丽珠单抗有更强的中和活性，而基因的微小突变可导致抗体对Ø表位的识别受限，从而影响抗体的作用。Tian D等[32]比较了最新分离的两种针对Ø的抗体D25和5C4，前者对RSV两种亚型均有较强的中和能力，而5C4对A亚型的结合能力远远高于B亚型，进一步研究发现造成该差异的原因可能是F基因201位点的突变。Sande C J等[31]认为，婴幼儿首次接触RSV产生的抗体与病毒亚型有关，即抗体对该亚型的亲和力高于对另一种亚型的亲和力，为解决这一问题，可采用联合疫苗接种或连续接种两种抗原的疫苗等方法。

尽管F蛋白在RSV病毒株间高度保守，但单克隆抗体及疫苗的广泛使用可能使F蛋白面临巨大的免疫选择压力，导致可逃逸抗体的突变被选择出来，影响抗体与F蛋白的结合能力，故利用基因测序技术选择相对保守的F蛋白表位作为抗体靶点可减少免疫逃逸的发生。

除了F蛋白，G蛋白对RSV预防的重要意义也逐渐受到重视。Cortjens B等[33]报道，在3例既往感染过RSV的健康受检者体内检测到G蛋白的中和抗体，且具有较强的中和活性。G蛋白的中央保守区(CCD)高度保守，含有CX3C趋化因子模体，可介导病毒与上皮细胞的黏附，抑制宿主的免疫反应，也成为单克隆抗体的靶点之一。在小鼠感染RSV后3 d使用针对G蛋白CCD的单抗131-2G，可减少炎症细胞向气道聚集[34]。Chirkova T等[35]发现，G蛋白中央保守区基因突变可削弱病毒对干扰素的抑制能力。