羊痘综合防治措施

2021-04-17郝良玉郭衍冰呼延含蓉程荣华刘沂霖李昱洁姚新华王改丽

吉林畜牧兽医 2021年11期

郝良玉，郭衍冰，呼延含蓉，程荣华，刘沂霖，李昱洁，姚新华，王改丽*

1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062；2.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062；3.吉林省畜牧业管理局，吉林长春 130000

羊痘是由羊痘病毒感染山羊、绵羊等动物的急性、接触性传染性疾病，包括山羊痘、绵羊痘和疙瘩皮肤病。羊痘病毒属包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和疙瘩皮肤病病毒。

在我国，羊痘又名羊“天花”，被列为一类重大传染性动物疾病，其传播快、发病高，不同品种、性别、年龄的羊均可感染，老年羊、哺乳期母羊、羔羊尤其新生羔羊更易感染，羊群的集中饲养不利于疫病防控，该病传播至无病例地区则易造成大流行，羊痘的流行给附近养羊户造成严重经济损失的同时也阻碍了养羊业和羊副产品贸易发展，故而在输入输出羊只时需加强检测。

1 临床表现

因羊痘病毒具有亲上皮特性，病毒粒子主要存在于病羊皮肤和黏膜处，且血液和口鼻分泌物中也含有病毒。临床上常以病羊无毛或少毛处皮肤和黏膜上出现典型痘疹为特征。病羊发病初期体温升高至39.5～41.5 ℃，部分病羊呆立或卧地不起，主要症状有食欲削减甚至停止，精神萎靡不振，眼结膜出现潮红，从鼻孔流出浆液性、黏液性或脓性分泌物，呼吸及脉搏加速；病羊皮肤出现豆粒大小的红斑，形成凸出皮肤的硬实丘疹，逐渐发展为结节、水疱或脓疮，浸润成片的疹块几天后开始脱落，部分羊病变部位疹块相互融合，病羊随病程延长呼吸愈发困难，加速死亡[1]。

若体况不佳、饲养管理差或出现继发感染可导致病羊死亡，怀孕母羊患病后流产概率极高，新生羔羊染病后易死亡，同时受感染羊群整体生产力大大下降，毛皮品质随之降低；若加强饲养管理，进行有效的对症治疗，可避免出现继发感染，病羊痊愈后可产生永久免疫力，重复感染率为零。

2 分子生物学特性

山羊痘病毒和绵羊痘病毒基因组约有150 kb，二者十分相似，约有96%的核苷酸完全相同。同大多数痘病毒一致，羊痘病毒是线性、双股DNA基因组[2]，分子质量约为(130×103)～(240×106)ku,由中间编码区和两端相同的反向互补序列构成，中心区包含所有保守序列的同源序列，内含病毒复制基因编码的必需因子，参与病毒转录、逆转录、病毒DNA复制、病毒粒子的构建和装配等过程。虽然山羊痘病毒和绵羊痘病毒具有较强特异性，分别只感染山羊和绵羊，但在实际生产生活中两者定义并不十分清晰，国内已有山羊痘和绵羊痘混合感染案例报道，这也增加了防控及治疗羊痘的难度。

3 P32蛋白特性

早期研究者对羊痘病毒结构蛋白进行分析时，发现一种能与山羊痘阳性血清特异性结合的蛋白，因分子质量为32 ku，故将其命名为 P32蛋白。进一步研究证实，SPPV和GTPV的P32蛋白与牛痘病毒晚期H3L基因编码的P35蛋白具有同源性，晶体结构相似，是目前分离鉴定羊痘病毒株中共有且特异性强的膜结构蛋白。P32蛋白也是羊痘病毒特有的囊膜结构蛋白，具有混合的α螺旋和β折叠结构，全长较难表达纯化[3]。作为典型的膜囊蛋白，P32蛋白在病毒感染早期即可刺激机体产生抗体，同时具有抗原特异性，由此引起研究者的广泛关注。P32蛋白可诱导机体产生强烈的细胞免疫，常作为靶标进行疫苗研究和诊断试剂开发。

K.Sumana等人对25次绵羊痘和山羊痘疫情中的28株分离毒株进行了系统发育分析，通过多位点序列分析P32基因结果表明，LSDV与SPPV的亲缘关系比GTPV更密切。SPPV和GTPV分离毒株中各基序具有稳定的保守结构和结合模式，如糖胺聚糖(GAG)、趋化因子(CX3C)，以及病毒特异性标记残基；另外，该研究团队以P32受体蛋白为基础，采用硫酸肝素和UDP-葡萄糖进行同源建模和对接，研究发现参与病毒附着的硫酸肝素具有保守的结合模式，并且糖基转移酶与UDP-葡萄糖的折叠度不同，这个发现可能有助于开发针对其他痘病毒的疫苗及建立相应诊断和治疗方法。

以重组P32蛋白为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)被广泛用于羊痘血清学诊断。成伟伟等人[4]将含有GST标签的重组P32蛋白表达纯化后免疫小鼠，结果发现该蛋白能够刺激机体产生较强体液免疫及细胞免疫，表明P32蛋白具有良好的免疫原性，可作为诊断抗原对羊痘病毒血清抗体进行监测，同时高效表达P32蛋白对研究该蛋白功能及羊痘疫苗研制具有重大意义。

4 常用诊断方法

PCR技术利用某段DNA为模板，通过变性、复性、延伸等步骤在聚合酶和核苷酸底物共同参与下对该段DNA序列进行大量扩增，是研究疾病感染过程发生、发展及转归的一种重要手段。多重PCR分析具备所需样品量较少、消除移液等操作误差、一个反应可设内部对照等优势。Ya等人建立了一种能够同时检测山羊、绵羊6种DNA和RNA病毒的多重PCR方法，包括口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍动物害虫病毒(PPRV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊传染性脓疱病毒(ORFV)。该方法对待检样品中一种或多种病毒均具有较高敏感性和特异性，通过一个PCR反应程序从六种病毒混合物中检测到至少100 pg病毒基因组DNA或RNA，可用于绵羊、山羊DNA和RNA病毒混合感染的临床诊断，为同时诊断绵羊和山羊6种病毒性疾病提供了方法。

实时荧光定量PCR方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，每经一轮循环便检测并记录荧光信号强度，进而达到实时监测PCR进程的目的，通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有灵敏度高、特异性强、高效简便等优点。理论上样品中只要有一个病原体存在，该方法就可以检测到，其检测限度最低可达10拷贝，通常2～3 h即可得出结果。杂交探针、染料与实时定量PCR技术相结合，可提高检测效率、增强检测灵敏度和特异性，也可实现一个反应同时检测多个目标基因。G.Venkatesan等人建立了一种基于TaqMan的双链探针实时荧光PCR检测方法，使用两对寡核苷酸引物和分别用Cy5/BHQ1和Hex/BHQ1标记的CaPV和ORFV杂交探针，其标准质粒的检测限度为20拷贝，CaPV和ORFV病毒基因组DNA的检出限为35 fg，该方法仅对靶向病毒具有特异性，对其它的羊常见传染病病毒无反应，检测结果组间差异极低、具有高度重复性。

G.Venkatesan等人以羊痘DNA聚合酶基因为靶点建立了一种环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，该LAMP方法检出率高于常规PCR方法，在检测限度和准确度上能够媲美荧光定量PCR，同时该方法不需要热循环阶段，极大地缩短了操作时间，可实现现场临床病例的快速诊断和疫病监测。