傅立叶变换离子回旋共振质谱及其在药学领域的应用

张艺馨 张筱宜 王玉记 王耀楠 赵 明

(首都医科大学药学院， 北京 100069)

傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 (fourier transformion ion cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR MS) 是基于测量磁场中离子回旋频率而获得离子质荷比信息的分析仪器。自1974 年Comisarow 和Marshall[1]发明的第一台FT-ICR MS仪器以来，其超高的分辨率(>1000000)、高质量精度(<1μppm)等分析特性，使它成为代谢组学、蛋白质组学、石油组学和复杂混合物研究的重要工具[2]。此外，它还可以与多种解离机制进行兼容，包括碰撞诱导解离(collision induced dissociation，CID)、红外多光子解离(infrared multiphoton dissociation，IRMPD)和电子捕获解离(electron capture dissociation，ECD)等，使FT-ICR MS成为大型复杂分子串联质谱分析的理想选择[3]。

1 傅立叶变换离子回旋共振质谱

1.1 仪器构成

FT-ICR MS包括进样系统、离子源、超导磁体、ICR分析池、数据处理系统等。为了确保ICR分析池中所需的<10-8托(Torr)的真空度，离子源通常放置在ICR分析池外部，之后离子再通过离子光学器件传输到分析池[4]。离子光学器件通常由形成多级电场的电极组成，通过对其电压进行控制，以确保离子在1道尔顿(Dalton，Da)或更小的质量窗口内的轨迹稳定性。此外，FT-ICR MS几乎可与所有离子源结合使用，包括电子轰击电离(electron impact ionization，EI)，化学电离(chemical ionization, CI)，快原子轰击(fast atom bombardment, FAB)，电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)，基质辅助激光解吸电离 (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)以及亚稳原子轰击[5](metastable atom bombardment，MAB)等，使FT-ICR MS可广泛适用于各种样品[6]。

ICR分析池是FT-ICR MS的核心部件，由捕获电极(trapping electrodes)、激发电极(excitation electrodes)和检测电极(detection electrodes)3对电极组成，如图1所示。其中，捕获电极用于轴向捕获离子；激发电极将离子激发到大的回旋半径；检测电极则用来检测离子运动产生的镜像电流。

图1 ICR分析池示意图

1.2 基本原理

FT-ICR MS的工作原理是测量均匀磁场中离子运动的频率，并将其转换为质荷比(m/z)。离子在磁场在中做圆周运动，其频率可表示为：

ωc=qB/m

其中ωc为回旋频率，q为离子电荷，B为磁场强度，m为离子质量[7]。

离子的激发和检测都是在ICR分析池内完成的，其运动可以描述为：离子以较低的动能进入分析池，在沿磁场矢量的方向上被捕获电极捕获，但是离子的初始回旋半径很小，为了检测到信号，在离子回旋运动平面上施加含有共振频率的射频电场，进而激发离子的同步回旋运动，之后旋转离子在检测电极中感应出图像电荷，从而在信号放大器的电路中产生镜像电流，该电流可以被放大并转换为间隔采样的数字信号，通过对时域信号进行傅里叶变换，即可得到频谱，最终转换为m/z[2]。图2为FT-ICR MS采集和获取质谱数据的过程。

图2 FT-ICR MS工作流程示意图[8]

1.3 串联质谱

为了获得更多的结构信息，通常通过多级质谱联用将分析物进一步裂解。串联质谱的分析结果受分离过程中各种解离方式的影响[9]，FT-ICR MS主要支持三种解离方式：CID、IRMPD以及ECD。CID是FT-ICR MS最常用的解离方式，其通过离子与中性气体之间发生非弹性碰撞，从而导致离子中解离能最低的键断裂[10]。IRMPD产生的裂解谱类似于CID，但是不需要破坏真空条件的气体脉冲[11]。另一种新开发的解离方式是ECD，在多肽和蛋白质的测序中具有显著的优势。它的原理是利用电子俘获时的能量增益来裂解肽键，而不是在化合物结构中解离能最低的键上发生断裂，从而不会丢失诸如糖基化和羧基化这样的翻译后修饰，可以提供更多的序列信息12, 13]。

2 傅立叶变换离子回旋共振质谱法在药学领域的应用

2.1 结构鉴定和元素分析

结构鉴定是药物分析的首要环节，而准确的质量测定需要尽可能高的分辨率。FT-ICR MS具有超高的质量精度和分辨率，可以确保未知物检测的准确性与重复性，从而提供准确的质量分析。Wu[14]等利用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV )-FT-ICR MS对盐酸莫西沙星进行了质谱分析，首次筛查发现5种新杂质，并对其中3种进行了结构确证。FT-ICR MS也可用于鉴定分子的自组装结构，为纳米粒子结构表征提供依据。Zhang[15]等通过FT-ICR MS，发现ICCA-WFF自组装形成三聚体结构。如图3所示，谱图中可以看到目标化合物(分子量为810)在809.34135、1619.69296、1214.52111的阴离子峰，分别为目标化合物单体、二聚体及三聚体的质谱归属。由于FT-ICR MS可以有效识别13C、15N、34S和18O的同位素精细结构，因此，它还可作为含杂原子化合物峰特异性挑选和元素组成测定的理想工具[16]。Miura[17]等提出了一种利用FT-ICR-MS对化合物进行元素分析的策略。在这项研究中，通过解析3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)和3,9-双[2-(3,5-二氨基-2,4,6-三氮杂苯基)乙基]-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷(CTU Guanamine)的同位素精细结构和峰面积的信息，进行元素的定量分析，计算结果与模拟数据均吻合良好。此外，FT-ICR MS还可以应用于小分子化合物的结构解析。MALDI谱图的低m/z区域(m/z<1000)通常包含大量来自组织样本内源性化合物的离子，而FT-ICR MS可以从众多的化学背景中区分出目标化合物，确定小分子的元素组成，在小分子药物及其代谢产物结构鉴定等领域具有一定优势[18]。

图3 ICCA-WFF的FT-ICR-MS谱图[15]

2.2 药物代谢与代谢组学

药物代谢研究是当今药物研发的重要组成部分，代谢物的鉴定对了解候选药物的代谢途径、毒理学研究和药效谱的优化至关重要[19]。FT-ICR MS的高质量分辨率、质量精度和动态范围，使其成为鉴定复杂生物样品代谢产物及进行代谢组学研究的有力工具。Yao[20]等利用超高效液相色谱(UHPLC)-FT-ICR MS 对口服帕博西尼(Palbociclib)的大鼠模型进行了代谢组学的研究，在尿液、粪便和胆汁样品中共检测和鉴定了29种代谢物，代谢途径包括羟基化、氧化、脱氢、N-脱烷基、羰基化、氧化脱氨、乙酰化、葡萄糖醛酸化、硫酸盐结合以及体内多种交叉代谢途径等，为日后的研究提供了相关的化学信息。此外，FT-ICR MS还可以确定化合物的靶向作用及释放过程。本课题组利用ESI(+)-FT-MS对S180小鼠的肿瘤组织、脏器提取物以及血浆中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-吉西他滨(RGDV-吉西他滨)进行了质谱分析。在肿瘤组织提取物和血浆中观察到了RGDV-吉西他滨的离子峰，并且在肿瘤组织的提取物中可以看到目标化合物降解结构的离子峰，而血浆中并没有。表明RGDV-吉西他滨能够靶向肿瘤组织，并且在血液循环的过程中不被降解21]。在代谢组学研究中，FT-ICR MS还可检测疾病的相关生物标志物。Liu[22]等使用UHPLC-FT-ICR-MS研究了三种不同方法诱发的发热大鼠的血浆代谢物，研究结果表明，三种不同方法引起大鼠发热的生物学过程不同，特异性的生物标志物可以区分不同方法引起的发热，为今后临床上发热的诊断和治疗奠定了一定基础。

2.3 中草药复杂体系

区别于化学药物，通常每种中药中都含有大量的化学成分，为了进一步深入中药的药理研究，提高中药材的质量控制，需要高效灵敏的检测技术对中药的有效成分进行分析和表征。FT-ICR MS另一个显著的特点是无需分离即可测定混合物中的大多数化合物，使其在中草药复杂体系的研究中显示出了巨大优势。Park[23]等通过15 特斯拉(T)FT-ICR MS对人参提取物中的天然化合物进行质谱分析，确定了123种人参化合物的分子式，其中包括33种人参皂苷。Cui[24]等利用UHPLC-FT-ICR-MS对甘遂半夏汤中的化学成分进行了检测，初步鉴定了62种成分，包括二萜、三萜、单萜、生物碱、类黄酮及其糖苷，为进一步研究该中药配方提供了化学依据。Han[25]等通过UHPLC-FT-ICR MS / MS初步鉴定了红景天提取物中64种化学成分，并在口服红景天后的大鼠血浆和脑组织中分别检测到24种和9种化学成分，所建立的UHPLC-FT-ICR MS/MS方法适用于中药的体内外化学成分的鉴定和表征，此外，通过研究药效成分在脑内的空间分布，可以进一步阐明中草药的治疗基础和作用机理。

2.4 蛋白质组学

FT-ICR-MS能够准确测定蛋白质中多肽链的数目和各肽段的氨基酸序列，还可以分析蛋白质翻译后修饰以及位点的特异性表征，从而实现对复杂生物样品中蛋白质的鉴定[26]。此外，多电荷完整蛋白质主要出现在1000～5000 m/z的窗口，而FT-ICR MS在该质量范围内可以获得6000000的分辨率，这使得该技术非常适合于蛋白质大分子的研究[11]。Anderson[27]等利用21 T的液相色谱(LC)-FT-ICR MS / MS对人结直肠癌细胞裂解物中提取的完整蛋白质进行了自上而下的蛋白质组学研究，鉴定出了372个大于30 kDa的蛋白形式，大大扩展了LC-MS / MS的可及质量范围。Burgt[28]等利用基质辅助激光解吸电离-源内衰减(MALDI-ISD) FT-ICR MS对单克隆抗体进行了质谱分析，蛋白质的深层结构信息可从超高分辨率MALDI-ISD谱图中获得，实现了针对单克隆抗体广泛的、可靠的结构表征。Anderson29]等通过21 T LC-FT-ICR MS的ETD / CID串联质谱对线粒体支链氨基转移酶(BCAT2)及其天然变体进行了自上而下的蛋白质分析，确定了BCAT2的变异位点，从而为基于片段的药物设计提供治疗靶点。此外，在质谱分析的结果中，ETD覆盖了蛋白质的N端和C端区域，而CID覆盖了更多的中心区域，这表明不同裂解技术的互补性及实用性。

3 展望

FT-ICR MS的超高分辨率和质量精度，使其在复杂混合物的元素鉴定和结构表征中展现出了巨大的潜力和优势，并发展成为分析化学药品、中草药体系、生物大分子等复杂样品的强大工具。作为一种分析技术，FT-ICR MS仍在开发之中，增加电磁振荡频率可以提高FT-ICR MS仪器的性能，因此对超导磁体提出了更高的要求，相应的，也应进一步优化数据处理系统以用于样品高通量的鉴定，但是另一方面，仪器高昂的成本一定程度上也限制了其推广，为了应对这一挑战，应重视技术革新来降低其运行成本。例如可提高超低温泵中液氦的回收效率，以减少液氦装填次数，节约成本。此外，FT-ICR MS仪器的操作和数据分析方面专业技能的培训也是实现FT-ICR高性能的关键。相信随着该设备的普及，FT-ICR MS必定会在生物医药领域得到更充分的应用。

致谢

本论文是在2020年北京高等学校高水平人才交叉培养“实培计划”项目和2020年度首都医科大学科研训练项目资助下完成的。感谢多肽及小分子药物北京市重点实验室和内源式预防药物教育部工程研究中心。