破骨细胞敲除PDK1基因对PMMA颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解抑制作用的实验研究*

张保德，宗少晖

（广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，南宁 530021）

全球每年有数百万例患者接受关节置换术，且呈逐年递增趋势。人工关节置换术是治疗各种终末期骨性关节病最普遍、有效的方法，但随着假体植入时间的延长，假体发生磨损，导致不同程度的磨损微粒产生，是局部骨溶解、炎性假瘤及假体无菌性松动（aseptic loosening,AL）的主要原因[1-3]。研究发现，破骨细胞性骨质溶解和骨吸收继发于巨噬细胞吞噬/胞饮磨损颗粒后所引发的机体免疫反应[4-6]。据报道，磨损微粒通过刺激巨噬细胞等炎性细胞释放大量化学介质，促进破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，抑制破骨细胞凋亡，增强骨吸收破骨细胞活性，使假体周围发生骨溶解[2,6-10]。本实验旨在通过建立聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）颗粒骨吸收动物模型来研究敲除破骨细胞3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）基因对PMMA 颗粒诱导颅骨骨溶解、破骨细胞形成及骨吸收活性的影响，为临床治疗和预防人工假体周围骨溶解导致的无菌性松动提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6雄性8周龄野生型小鼠12 只，由广西医科大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SYXK 桂2020-0004）。破骨细胞敲除PDK1 基因C57BL/6 雄性小鼠6 只，本课题组自行繁育所得，称重并标记。温度（23±2）℃，相对湿度（50±10）%。

1.2 PMMA 颗粒的制备 PMMA 颗粒购自美国Polysciences 公司，形态规则、微球形，直径1～10 μm，经扫描电镜（HITACHI Regulus 8100）检测证实颗粒平均直径6.0 μm，95%颗粒直径＜10 μm。将颗粒溶于75%乙醇，室温下振荡清洗4 次，每次1 h，100%乙醇浸泡灭菌，12 h 后用PBS 清洗4 次，每次1 h，将处理后的PMMA 颗粒重悬于无血清α-MEM培养基中，配成浓度为30 g/L的溶液，于4 ℃冰箱中保存备用[11]。

1.3 实验分组及骨吸收模型建立 将12只C57BL/6野生型小鼠随机分为假手术（Sham）组和PMMA+C57BL/6组，每组6 只。6 只破骨细胞敲除PDK1 基因C57BL/6 小鼠为PDK1 基因敲除（PMMA+KO）组，其中PMMA+C57BL/6组和PMMA+KO组术中均添加PMMA颗粒。

颅骨骨吸收模型的建立：1%戊巴比妥钠20 mg/kg剂量腹腔注射，待麻醉后用绷带将四肢及头部固定于自制小动物手术台上，俯卧位，用无菌眼科剪剔除小鼠头顶部毛，碘伏棉球消毒头部皮肤，75%酒精脱碘，无菌条件下在小鼠颅骨正中矢状缝位置纵向切开头皮，大小约0.5 cm×0.5 cm，暴露外骨膜，用骨膜剥离器剥离外骨膜，显现颅骨，PMMA+C57BL/6组和PMMA+KO组注入30 g/L PMMA 颗粒悬液100 μL，Sham组注射不含PMMA 颗粒的α-MEM培养液100 μL，4-0 线间断缝合，建立骨吸收动物模型。每只小鼠术后均给予肌肉注射注射用青霉素钾3 万单位，防止术后感染。所有小鼠饲养在SPF级屏障环境，自由活动，饮水进食。

1.4 颅骨Micro-CT分析骨吸收溶解变化情况 10 d后，Sham组、PMMA+C57BL/6组、PMMA+KO组各取3只小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取小鼠头骨，剔除外层皮肤和肌肉，立即用4%中性多聚甲醛固定液固定，48 h 后取出用无菌PBS 浸泡清洗3 次，每次5 min。然后利用Micro-CT 机扫描颅骨，观察各组小鼠颅骨骨吸收溶解变化情况。

1.5 组织切片的制备 参考Warashina 等[12]动物样本取材制备方法，处死小鼠后取头顶骨，4%中性多聚甲醛固定48 h，常规组织脱钙、脱水、石蜡包埋，连续切片（厚5 μm），分别行苏木精—伊红（HE）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。

1.6 骨组织计量学分析组织切片行常规HE 染色，光学显微镜下观察颅骨各类骨相关细胞分布和骨表面溶解侵蚀情况，每组选3个样本进行分析，采用Image-Pro Plus 6.0（IPP）图像分析软件测量颅骨正中矢状缝区域骨吸收溶解面积，并计算骨溶解面积百分比。TRAP 染色是破骨细胞的特异性染色。临近骨组织的区域胞浆染色呈鲜红色阳性，胞核≥3个为破骨细胞。Olympus 电子显微镜下，每个样本采集5 个不同的视野，通过形态学计算正中矢状缝区域的破骨细胞数量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠颅骨Micro-CT扫描结果 术后10 d，PMMA+C57BL/6组较Sham组颅骨骨破坏溶解面积显著增加，PMMA+KO组较PMMA+C57BL/6组颅骨骨溶解面积明显减少，见图1。

2.2 颅骨骨组织切片HE染色结果 PMMA+C57BL/6组颅骨骨吸收明显增加，颅骨表面可见大量炎性肉芽组织侵袭及瘢痕组织生成，同时可见大量炎性细胞（如巨噬细胞、多核巨细胞、成纤维细胞等）和破骨细胞。与Sham组相比，PMMA+C57BL/6组颅骨骨破坏溶解面积明显增加（P＜0.01）；而PMMA+KO组较Sham组相比溶解面积不明显（P＞0.05），较PMMA+C57BL/6组颅骨骨溶解面积显著减少（P＜0.01），见图2。

2.3 颅骨骨组织切片TRAP 染色结果 在置入PMMA 颗粒后，破骨细胞数目显著增加，光镜下可见许多骨吸收陷窝和临近骨组织区域呈鲜红色胞浆阳性的破骨细胞（黑色箭头所示）。与Sham组相比，PMMA+C57BL/6组破骨细胞数目明显增多（P＜0.01）；而PMMA+KO组较PMMA+C57BL/6组破骨细胞数目显著减少（P＜0.01），PMMA+KO组与Sham组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图1 骨溶解术后10 d Micro-CT 扫描观察骨溶解三维重建情况

图2 PMMA颗粒骨溶解诱导模型（HE染色，×4）及各组骨溶解面积百分比

图3 PMMA颗粒骨溶解诱导模型（TRAP 染色×20）及各组破骨细胞数目

3 讨论

人工关节置换术是目前骨科的主要进展性手术之一，在临床上广泛用于解除老年骨性关节炎、创伤性关节炎、类风湿性关节炎、老年股骨颈骨折等疾病所引起的疼痛和功能障碍并恢复关节功能，让患者提高生活质量恢复基本日常生活活动。但是，相当多的患者在关节置换后经历了无菌性松动（aseptic loosening，AL）。AL 的唯一有效纠正方法是手术翻修。一种较新的策略涉及开发新的药理学方法以改善AL相关的骨溶解。目前认为磨损颗粒被巨噬细胞被吞噬/胞饮后通过各种机制，如细胞因子和趋化因子的释放、巨噬细胞集落刺激因子的增加、级别配体表达的增加和蛋白酶的诱导等激活破骨细胞并导致破骨细胞前体细胞增殖分化为破骨细胞，最终导致骨溶解吸收[2,5,13-14]。

PDK1 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可调控细胞生长、代谢、增殖、分化及凋亡等，其作为主激酶负责许多其他AGC激酶的磷酸化和激活，且仅在磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯或磷脂酰肌醇3,4-二磷酸酯的脂质囊泡存在时才能激活蛋白激酶B（Akt）苏氨酸残基Thr308位点及其下游靶蛋白等，并使其磷酸化或抑制[15-17]。目前涉及细胞核因子-κB受体激活配体（receptor or activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）与其膜受体细胞核因子-κB受体活化因子（receptor or activator of nuclear factor-κB,RANK）结合的信号通路是破骨细胞分化、存活和骨吸收能力的关键[18]，除NF-κB 外，RANKL 还参与PI3K/Akt和MEK/ERK等信号途径以促进破骨细胞活化。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PDK1 是多种细胞信号通路中的关键节点[19-20]，有实验发现，PDK1 在破骨细胞活化及自噬诱导中具有强大的中心调控作用，抑制PDK1 可促进破骨细胞凋亡[21-22]。而敲除破骨细胞内该基因能否抑制AL 相关骨溶解的发展？基于此，本实验构建了破骨细胞敲除PDK1基因小鼠，结果显示，与Sham组相比，敲除破骨细胞PDK1 基因后能显著抑制由PMMA颗粒诱导的骨溶解。

综上所述，通过敲除小鼠体内破骨细胞PDK1基因可抑制破骨细胞的生成，进一步抑制PMMA颗粒诱导的骨质溶解和吸收，证实PDK1 在破骨细胞活化中起重要作用。