APP下载

Septin9基因、缺氧诱导因子1与结直肠癌发生发展的相关性

2021-04-17宋慧琴张君娜

广州医科大学学报 2021年1期
关键词:甲基化引物试剂盒

宋慧琴,张君娜

(河南大学第一附属医院病理科, 河南 开封 475000)

结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤,其在全球范围内的发病率和死亡率分别占恶性肿瘤的第4位和第3位[1]。近20年来,结直肠癌在西方发达国家的发病率呈明显下降趋势;但随着我国经济社会发展,国民饮食结构和生活习惯改变及人口老龄化进程加快等原因,结直肠癌在我国呈升高趋势[2]。最新数据显示,我国结直肠癌的发病例数为37.63万人,因结直肠癌死亡患者19.10万人,结直肠癌发病率和死亡率均位于我国恶性肿瘤前5位[3-4],给我国人民生命健康带来严峻挑战。但结直肠癌早期症状不明显,大多数患者确诊时已处于中晚期,因此,早诊、早治成为结直肠癌防治和预后的关键。Septin 9基因是结直肠癌发生中重要的抑癌基因[5],本文研究Septin 9基因在结直肠癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般临床资料

收集我院2018年1月~2019年1月结直肠癌组织标本60例,均经手术切除,取自结直肠癌组织病灶中心,其中男36例,女24例;年龄37~80岁,平均年龄(56.5±13.5)岁;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期43例,Ⅲ~Ⅳ期17例;组织分化程度:低中分化49例,高分化11例;淋巴结转移:N0-152例,N2 8例;远处转移:M0 47例,M1 13例。选取同期在我院体检的结直肠良性病变(介质肠炎、息肉)组织标本30例作为对照组,均经手术切除,取自正常肠组织标本边缘,其中男15例,女15例;年龄35~80岁,平均年龄(55.7±14.2)岁。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05),具有临床可比性。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准:首次诊断,既往未接受手术、放疗或化疗等治疗者;患者均完全知情并签署知情同意书。

排除标准:合并其他部位恶性肿瘤者;合并糖尿病、高血压、心脏病等疾病者。

1.3 仪器与试剂

TRIzol DNA提取试剂盒(美国Thermo-Fisher公司);逆转录试剂盒(TransGen Biotech公司);NanoDrop 2000C核酸蛋白分析仪(美国Thermo-Fisher公司);ABI 7500型实时荧光定量PCR扩增仪(美国ABI公司);凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);anti HIF-1α抗体(美国abcam公司);蛋白提取试剂盒、二抗(北京中山金桥生物科技公司);聚偏氟乙烯膜(美国Millipore)。

1.4 方法

1.4.1RT-PCR法检测Septin 9 mRNA、HIF-1α mRNA表达 取患者空腹静脉血10mL,3000rpm/min离心10 min,分离得血浆,TRIzol法提取组织RNA,核酸蛋白分析仪评估RNA质量,逆转录合成cDNA,进行PCR扩增,扩增条件:94 ℃×5 min,1个循环;95 ℃×25 s、62 ℃×40 s,65℃×30 s,10个循环;93℃×25 ℃,58 ℃×40 s,65 ℃×30 s,21个循环;65℃×10 min,1个循环;产物经琼脂糖凝胶电泳,以GAPDH为内参。采用Bio-Rad软件分析条带灰度值,目的RNA表达量=目的RNA灰度值/GAPDH灰度值。Septin 9上游引物:ATTCGTTGTGTATT AGTTATTAT,下游引物:GCAACAACCAACCCAAC;HIF-1α上游引物:5′-TGCATCTCCACCTTCTACCC-3′,下游引物:5′-CTGCTCCATTCCATCCTGTT-3′。GAPDH上游引物:5′-CAAGGCTGAGAACGGGAAGC-3′,下游引物:5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

1.4.2Western bloting法检测Septin9蛋白和HIF-1α蛋白水平 采用蛋白提取试剂盒提取结直肠癌病灶蛋白,10% SDS-PAGE凝胶电泳,室温下,5%脱脂奶中封闭2 h,加入抗HIF-1α抗体(1∶1000),4℃过夜,0.1% TBS-Tween-20中洗涤,加入兔抗IgG二抗,室温下孵育1h,采用Chemi DocTM MP系统对印迹进行扫描,使用Image J1.51软件对条带进行定量分析。以β-actin为内参照,采用目标蛋白与β-actin蛋白条带灰度比值代表该蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 结直肠癌患者与对照组患者Septin 9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平对比

两组患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05),结直肠癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2 结直肠癌患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平与临床资料相关性

不同性别、年龄结直肠癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);不同TNM分期、分化程度、淋巴结转移和远处转移结直肠癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05),TNM Ⅲ~Ⅳ期患者的水平显著高于TNM Ⅰ~Ⅱ期患者,高分化患者的表达水平显著高于低中表达患者,淋巴结转移N2级患者显著高于N0-1患者,远处转移M1患者显著高于M0患者。见表2。

表1 结直肠癌患者与对照组患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平对比

表2 结直肠癌患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达水平与临床资料相关性

2.3 Septin9蛋白与HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平的相关性

Pearson相关性分析结果显示:Septin9蛋白表达水平与HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平呈正相关(r=0.286,P<0.001;r=0.213,P<0.001)。

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个逐渐发展的复杂生物学过程,而原癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生的根本原因。其中抑癌基因是一类可抑制细胞增殖从潜在抑制癌变作用的基因,在正常生理条件下,抑癌基因通过促进细胞凋亡,或抑制细胞周期等对细胞内增殖信号进行监测,防止细胞异常增殖,从而实现抑制癌症的功能[6]。

Septin基因是广泛存在于真核生物细胞中,在人类细胞中由14个家族成员组成,即SEPT1~14,其中Septin9定位于17q25.3,有多个亚型(Septin 9-v1、v2、v3、v4),结构上由位于中央的p-loop GTP结合域、可变的N端和C端结构域组成,与DNA修复、迁移、凋亡等细胞功能有关[7-8]。目前研究认为,Septin9基因主要通过CpG岛甲基化参与结直肠癌发生发展过程,Septin9甲基化一方面使其自身构象发生变化,不利于转录因子与基因的结合,空间上抑制了基因的表达[9],另一方面甲基化后招募并结合甲基化CpG结合域蛋白(MBDS),MBDS并招募其他蛋白质,形成不活跃的异常染色质,从而抑制基因的表达[10]。基于血浆Septin9甲基化检测试剂盒已被美国食品药品监督管理局和国家食品药品监督管理总局批准用于结直肠癌早期筛查,其检出结直肠癌的敏感性为79.3%(1/3算法)~95.6%(2/3算法),特异性为84.8%(1/3算法)~99%(2/3算法)[11-12]。

同时,诸多研究表明,Septin9还可以通过HIF-1通路、Rho途径、JNK通路等多种信号通路参与肿瘤的发生发展[13]。HIF-1是细胞缺氧状态下广泛存在的核转录调节因子,由HIF-1α和HIF-1β亚单位构成,低氧环境下,HIF-1α不能迅速生成和降解,只能与HIF-1β形成异二聚体,并与目标基因DNA启动子序列的低氧反应元件结合,通过多种信号通路激活血管内皮生长因子转录基因,促进肿瘤生存和增殖;当缺氧状态得到改善时,HIF-1α被迅速降解。而缺氧是实体瘤生长的重要特征,因此,研究认为HIF-1α在血管生成、细胞增殖、能量代谢、细胞黏附等相关基因的调控方面占据重要地位[14]。

本文研究发现:结直肠癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白水平显著高于对照组(P<0.05);结直肠癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达水平与性别、年龄无关,而与TNM分期、分化程度、淋巴结转移和远处转移结相关,TNM III~IV期患者的水平显著高于TNM I~II期患者,高分化患者的表达水平显著高于低中表达患者,淋巴结转移N2级患者显著高于N0-1患者,远处转移M1患者显著高于M0患者。Septin9蛋白表达水平与HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表达水平呈正相关(r=0.286,P<0.001;r=0.213,P<0.001)。上述结果说明Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白与结直肠癌发生发展密切相关,其可能机制为Septin9蛋白高表达抑制HIF-1α泛素化降解途径,从而促进HIF-1α表达,促进肿瘤发生发展,与文献报道一致[15-16]。

Septin9基因在结直肠癌的发生、发展中起重要作用,阐明其在结直肠癌中表达情况及生物学功能,使其成为结直肠癌基因治疗的理想靶点,正受到越来越多关注

猜你喜欢

甲基化引物试剂盒
病原菌多重核酸检测试剂盒分析性能质量评价研究
一种肿瘤甲基化谱纯化的统计方法朱宜静
甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立
甜菜全基因组SSR引物的筛选与评价
5-氮杂胞苷调节植物基因表达研究进展与应用展望
玉米品种德美亚多重SSR-PCR系统的建立及应用
甲基苯丙胺改变成瘾小鼠突触可塑性基因的甲基化修饰
植物DNA甲基化研究进展
农药残留快速检测试剂盒的制备方法及其应用研究
为什么确诊新冠肺炎需要核酸检测试剂盒?