重组禽流感病毒的鸡胚生产工艺控制要点

2021-04-16陈金仙

吉林畜牧兽医 2021年1期

陈金仙

广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州 511356

1 鸡胚的选取

鸡胚生产重组禽流感病毒工艺最大的缺点是容易受鸡胚来源、质量及自身不稳定性的影响，造成疫苗批间质量差异显著。所以鸡胚的选取是重组禽流感病毒液生产的基石，对能否生产出高品质的重组禽流感病毒液有着至关重要的作用。选取优质的鸡胚则从种蛋的选取开始。鸡蛋主要是由蛋壳、蛋壳膜、气室、蛋白、蛋黄及胚珠等部分构成，受精后的种蛋经孵化后成为鸡胚。种蛋的选取要考虑种蛋的来源、大小和形状、蛋壳、清洁度、新鲜度、保存过的环境等因素。

1.1 种蛋的来源要求

高致病性禽流感灭活疫苗的抗原主要为H5N1亚型 Re-11 株、H5N1 亚型 Re-12 株和H7N9 亚型H7-Re3 株的重组禽流感病毒液。如选取的鸡胚具有相对应亚型的母源性抗体，则所接种的重组禽流感病毒将不能在鸡胚内进行大量繁殖，病毒的繁殖便掐然而止。因此所选取的鸡胚不能有抑制所接种病毒繁殖的母源抗体。一般选择来自健康无病鸡群或SPF 鸡群的新鲜受精蛋，即选取非免疫鸡胚或SPF 鸡胚。

1.2 种蛋的大小和形状要求

鸡胚的孵化在孵化机内进行，过小的鸡蛋孵化翻蛋的过程中容易被晃动弄破，而且会导致后期机器接种不上或是导致尿囊液的收获量大大减少等，因此所选取的鸡胚不能过小。过大的鸡蛋则很难挤进蛋托，也容易在蛋托里被挤破。过大的蛋不仅孵化率低而且胚胎的占比大也会导致尿囊液收获量的减少，因此所选取的种蛋不能过大。形状过长、过圆、腰鼓形、橄榄形（两头尖）、扁形、锥形（一头尖）等畸形的蛋也会降低孵化率，因此种蛋的形状应当为正常的椭圆形（气室头稍大）且蛋形指数（蛋的纵径与横径的比值）在1.30 ～1.35 最好。综上，应选取重量约为55 ～65 g 正常蛋形的种蛋，有利于孵化、接种和收获。

1.3 种蛋蛋壳要求

蛋壳过薄或表面粗糙的鸡胚，在孵化的过程中容易破损。白壳蛋在照蛋的过程中比较容易观察，沙壳蛋则不利于照蛋观察。所以选取的种蛋的蛋壳应该是致密均匀、厚度适宜、没有破裂、且容易观察，没有沙壳的白壳蛋。

1.4 种蛋的清洁度要求

种蛋的表面经常会沾有鸡粪、尘土、霉斑、破蛋液等污物，从而容易滋生细菌，甚至是堵塞蛋壳的气孔影响鸡胚的气体交换，导致鸡胚在孵化的过程中死去，降低孵化率。而且污染的蛋壳如消毒不当则容易污染收获的病毒液，或是间接造成生产出的病毒液内毒素偏高，严重影响病毒液的质量甚至是导致大批次的混合病毒液报废，造成不可逆的经济损失。所以选取的种蛋表面清洁程度要好，或者在入孵前要对污染不严重的种蛋进行严格的清洗和消毒，保证入孵的种蛋有良好的清洁度。

1.5 种蛋的新鲜程度和气室要求

鸡胚接种重组禽流感病毒后，收获的病毒液主要是鸡胚的尿囊液。如果鸡胚的气室偏大，收获的尿囊液也会大大减少，从而影响重组禽流感病毒液的产量。鸡胚的气室过大一般是由于保存时间过长导致鸡蛋里面的水分流失造成的。当鸡胚的气室或是游移时会很不利于接种和收获，所以选取的种蛋应当新鲜，保存的时间不宜超过7 d，且气室大小和位置正常。

1.6 种蛋的保存要求

种蛋胚胎发育的临界温度为23.9 ℃，超过这个温度的种蛋就会开始发育，尽管可能发育程度小，但是由于细胞代谢可能导致鸡胚衰老甚至是死亡，从而造成孵化率偏低；而且还会导致接种时的胚龄偏大影响病毒液的产量和效价。如种蛋保存的温度过低，其孵化率也会受到影响，低于10 ℃会降低孵化率，低于0 ℃甚至会受冻而失去孵化能力。种蛋保存的湿度过低则容易造成蛋内的水分通过气孔向周围的环境中蒸发而导致气室过大，湿度过高又容易导致种蛋表面长菌或是发霉，所以选择的种蛋自产出后在孵化前应当一直处在合适的温湿度条件下进行保存和运输。

1.7 其他

还有一些种蛋有可能是双黄蛋，这种种蛋的蛋形往往会较普通的蛋大且长，一般肉眼可分辨出来。这种蛋不适宜接种病毒，孵化前要予以剔除。

2 种蛋的消毒

种蛋产出后，其表面常常会受到污染导致微生物在蛋壳的表面大量繁殖，微生物有可能会通过气孔进入蛋内，也有可能在接种后通过针孔污染鸡胚，还有可能会在收获后被带到病毒液里面，造成污染或是内毒素偏高。所以种蛋在入孵前要经过严格的清洗和消毒。消毒方法一般有熏蒸消毒、浸泡消毒、喷雾消毒等。

2.1 熏蒸消毒

熏蒸消毒一般为福尔马林（甲醛）熏蒸法，此法消毒效果最好。可将种蛋放在专用的密闭消毒室或消毒箱内，按每立方米容积30 mL 甲醛，15 g 高锰酸钾配制消毒液。先调节消毒区的温度在25 ～27 ℃，相对湿度为60%～80%，先用陶瓷类的容器装好高猛酸钾放入消毒区，然后加入甲醛，让种蛋在该密闭的空间熏蒸30 min 后，打开密闭空间，排出甲醛气体。由于甲醛和高锰酸钾的反应剧烈，而且腐蚀性强，容易伤及人的呼吸系统和眼睛等。而且甲醛属于一类致癌物，对环境的污染和工作人员的健康影响极大，一般不推荐用此法进行种蛋消毒。

2.2 浸泡消毒

浸泡消毒是将种蛋放到消毒液进行短暂的浸泡后取出晾干。最常见的是将种蛋浸入含有活性氯1.5%的漂白粉溶液中，3 min 后取出晾干，或是将种蛋置于0.1%的碘酊溶液内浸泡0.5 ～1 min 取出晾干即可，消毒液浸泡一定数量的种蛋后要更换。浸泡消毒的消毒效果还是比较好的，但是操作不便且繁琐，需要耗费大量的消毒液，所以一般大规模的生产中很少采用。

2.3 喷雾消毒

喷雾消毒是通过喷雾剂将消毒液直接喷到种蛋的表面上。常用的消毒液有1:1 000 的新洁尔灭溶液（季胺盐类），1:500 的百毒杀溶液，1:500 的戊二醛溶液，1:500 的氯己定溶液（双胍类）、0.2%的过氧乙酸溶液等等。喷雾消毒的有效性虽然比不上前面两种那么全面彻底，但是操作简单且成本低，大规模生产时往往采用此法。

3 鸡胚的孵化

影响鸡胚孵化的条件主要有温度、湿度、通风换气、翻蛋和凉蛋等。种蛋在接种前需要经过10 ～11 d 的孵化。接种后经3 ～4 d 孵化后收获。

3.1 孵化设备

鸡胚的大规模孵化采用巷道式孵化机进行。这种孵化机配备空气搅拌和导热系统，能够很好地利用鸡胚的代谢热，箱体内没有死角，温度均匀，不仅省电，而且孵化效果好。孵化机在入孵前要进行熏蒸消毒。

3.2 孵化温度的控制

鸡胚在孵化的过程中，温度是最重要的影响因素。它影响着胚胎的生长、发育和活力，过高或过低的温度都不利于鸡胚的发育。温度偏高会使鸡胚发育快，鸡胚的活力弱，一旦超过42 ℃，2 ～3 h后就会导致胚胎死亡。温度偏低会使鸡胚的发育迟缓，若温度低于24 ℃，30 h 后就会导致胚胎死亡。鸡胚孵化的最佳温度与鸡胚的品种、大小和胚龄、孵化的环境和季节等有很大的联系。在生产实践中，在不同的孵化时期，可以根据胚胎的发育状态，给予合适的温度。如胚胎发育偏快，说明孵化的温度偏高，应适当降低孵化温度；如胚胎发育偏慢，说明孵化温度偏低，可适当升高孵化温度；如胚胎发育符合标准，说明孵化温度合适。这就是根据鸡胚的发育规律，“看胎施温”的技术。这需要技术人员要有非常专业的判断能力，才能正确地把控好这门技术。一般而言，1 ～3 日龄的鸡胚最理想的孵化温度为38.5 ℃，4 ～12 日龄的鸡胚最理想的孵化温度为37.8 ℃。

3.3 孵化湿度的控制

孵化机内的湿度也对鸡胚的发育有较大的影响。适宜的湿度在鸡胚孵化的前期能使鸡胚受热均匀，后期有利于鸡胚的散热。湿度过高或是过低都会影响鸡胚的正常物质代谢。湿度过高，鸡胚内水分蒸发受阻，妨碍鸡胚的气体交换，影响鸡胚发育，导致鸡胚活力不强。湿度过低，鸡胚内水分蒸发过多，不仅导致鸡胚的胚胎与壳膜黏连，而且也会间接导致最后收获的病毒液的量大大减少。一般的情况下，1 ～7 日龄的鸡胚在孵化时相对湿度为60%～65%有利于羊水和尿囊液的形成，7 日龄以后的相对湿度可调为50%～60%有利于排除羊水和尿囊液。

3.4 孵化时要经常通风换气

鸡胚在发育的过程中会进行有氧呼吸，与外界进行气体交换，即吸入氧气，排出二氧化碳。特别是随着胚龄的增长，有氧呼吸会逐渐增强，气体交换量变大。这需要随着胚龄的增加，逐渐加大通风换气量。随着胚龄的增大，鸡胚的产热也会增强，如果散热不好还会导致鸡胚积热致死，加强通风换气则能有利于鸡胚散热，提高孵化率。当孵化机内二氧化碳含量大于0.5%会使鸡胚发育缓慢，产生畸形，甚至是死亡。正常的情况下，孵化机内的空气含氧量21%，二氧化碳0.03%是最合适鸡胚孵化的。因此孵化的过程中要定时检测孵化机内的通风换气情况。

3.5 孵化过程中要翻蛋

种蛋的蛋黄含脂肪多，密度较小容易浮在蛋的上面。而胚胎在蛋黄之上，所以在孵化的过程中，鸡胚长时间不动，胚胎容易与壳膜黏连。因此，鸡胚孵化的过程中要定时进行翻蛋。翻蛋能使鸡胚各部受热均匀，防止蛋白沾连，促进羊膜运动和空气流通，改善胎膜的血液循环，有助于胚胎发育。一般的情况下，翻蛋每2 h 进行一次，角度在水平位置上前俯后仰各45°，且轻、稳、慢。

3.6 孵化过程中要适时晾蛋

鸡胚发育到中期以后，鸡胚的物质代谢会使孵化机内产生大量的生理热，此时适当的凉蛋能够帮助鸡胚散热，促进气体代谢，提高鸡胚的血液循环机能，增加鸡胚的活力。凉蛋可以根据鸡胚的发育情况灵活进行。

3.7 孵化过程注意事项

鸡胚在入孵前，必须都要大头朝上（即气室在上），这不仅有利于鸡胚在孵化过程中的有氧呼吸，而且后面的接种和收获也要求气室朝上。如果倒立孵化容易造成接种位置不准确而容易扎到鸡胚的要害部位导致鸡胚死亡，且会导致机器收获的过程中吸入大量的蛋黄。虽然现在的孵化机有着智能化的控制系统，但是生产技术人员还是得定时检测孵化机内的温度、相对湿度、通风情况和翻蛋是否正常。在鸡胚接种前，至少要用照蛋灯观察鸡胚两次，及时地剔除无精蛋、死胚蛋和弱胚蛋等。

3.7.1 鸡胚孵化后第一次照蛋

第一次照蛋在入孵后5 ～6 d 进行，此次照蛋主要是剔除无精蛋、死胚蛋、弱胚蛋和破壳蛋，提高蛋盘的利用率和观察鸡胚的发育水平是否符合胚龄。有些无精蛋或死胚蛋在孵化机内如果没有及时地剔除，在孵化的过程中，鸡蛋内部会代谢产生大量的气体（如硫化氢、氨气等），甚至会导致鸡蛋发生“爆炸”，把大量的污染的蛋液喷射到其他的种蛋上，从而影响其他鸡胚的发育甚至是造成二次污染。如发现有已经“爆炸”的蛋，则必须及时清理和消毒。如照蛋的过程中发现大头（气室）向下的蛋也要及时地纠正。此次照蛋的活胚蛋处于起珠、双珠阶段，主要特征是气室边缘明显，胚胎上浮，隐约可见胚体弯曲，头部大，有明显黑点，躯体弯，有血管向四周扩张，分布如蜘蛛状，可见明显胚动。弱胚蛋则胚体小，血管色浅且纤细，扩张面小。死胚蛋的气室边缘界线模糊，血管昏暗模糊，无胚动。无精蛋则蛋内透明，没用任何的血管或血丝，可见模糊的卵黄阴影，气室边缘界线不明显。在照蛋过程中要将挑出来的破壳蛋、无精蛋、死胚蛋和弱胚蛋严格的按照相应的操作规程处理，避免造成环境污染。

3.7.2 鸡胚孵化后第二次照蛋

第二次照蛋的胚龄在10 ～11 d，此次照蛋主要是剔除死胚蛋、弱胚蛋和发育不正常的鸡胚。保证接种的鸡胚是活力足够好、胚龄符合要求、且气室位置正常的种蛋。此次照蛋的活胚蛋处于合拢阶段，蛋内气室增大，边界明显，血管红润粗大，尿囊血管明显向尖端（蛋的小头）“合拢”，还可观察到鸡胚明显的胚动。弱胚蛋则尿囊血管未向蛋小头合拢，蛋小头色淡透明，血管明显色浅纤细。死胚蛋则气室明显增大，边界不明显，蛋内半透明无血管分布或是血管萎缩。此次照蛋完毕后的活鸡胚即可送入病毒接种区，用配制好的重组禽流感病毒液进行尿囊腔接种。

4 重组禽流感病毒的接种

与接种有关的器具在接种前都要进行严格的灭菌和消毒，避免造成污染。

4.1 鸡胚的手工接种

接种前，利用记号笔通过照蛋灯勾出气室，于气室稍下方胚胎活跃且血管明显的区域中，在血管之间的间隙（避开大血管区域），在胚胎面与气室交界之边缘1 mm 画上一点作为记号，此点作为接种点。先配制好重组禽流感病毒稀释液放一旁待用。再用5%的碘酊棉以接种点为中心进行消毒，随后用75%的酒精棉进行脱碘。然后用灭菌的打孔器在接种点打一小孔，最好不损伤壳膜。接着用吸取有重组禽流感病毒液稀释液的注射器垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，刺入深度大约15 mm，向尿囊腔内注入0.1 mL 病毒液。注射完毕后后，用熔化的石蜡进行封口。病毒被注射到尿囊腔后，将会进入内胚层细胞中进行繁殖，繁殖后又会被释放到尿囊液中。

4.2 用接毒机对鸡胚进行接种

在大规模生产中往往采用全自动的接毒机对鸡胚进行接种。使用接毒机进行接种主要控制的要点是：①接毒机在接毒前要进行彻底的消毒灭菌处理，防止造成污染，特别是安装接毒机头和种毒瓶等重要的操作要严格按照无菌操作的要求进行。②接毒的鸡胚最好能够大小均匀，接毒深度要调节好，保证接毒到位。若鸡胚偏大容易造成接毒部位扎得过深，鸡胚容易物理致死；若鸡胚偏小容易造成接毒不到位，病毒无法繁殖，则前功尽弃。③接毒量要准确，要定时检测接毒针头的出液量是否符合要求，若出液量不准，及时调整。④要时时观察鸡胚接毒机的打孔情况。避免打孔针在接毒的过程中弯曲造成接毒孔过大或是没有完成打孔等，因为这会加大对鸡胚的物理伤害或是导致没有接种成功。⑤接毒的过程中要定时对接毒针头进行消毒，防止交叉污染的发生。⑥在接毒的过程中也要时时观察消毒装置是否正常。

5 接种后孵化

接种完毕后，将鸡胚置于温度为36 ～37 ℃，相对湿度45%～55%的孵化机内进行继续孵化，不必进行翻蛋。由于鸡胚在接种时受到了物理创伤，接种后孵化的温度过高会很容易致使鸡胚死亡，温度过低则会导致鸡胚发育缓慢，不利于病毒的大量繁殖；湿度过高则容易造成鸡胚水分蒸发受阻，影响鸡胚进行气体交换，会降低鸡胚的活力，病毒的复制也会迟缓。湿度过低则容易造成鸡胚水分蒸发严重，从而导致收获的病毒液大大减少。由于接毒后的鸡胚胚龄已经比较大，气体交换也比接种前孵化时要多，所以接种后孵化对通风换气的要求更高，良好的通风换气能使鸡胚保持好的活力。病毒的复制与鸡胚的活力成正相关关系，鸡胚的活力越好则病毒的繁殖越旺盛。因此在孵化的过程中对温湿度和通风换气的控制非常地重要。所以要定时检查孵化机内的温湿度和通风换气是否正常。良好的培养条件能够提高收获病毒液的HA 效价。

鸡胚接种后孵化的过程中，每日要对鸡胚进行照蛋两次，24 h 前死亡的鸡胚全部丢弃。一般24 h内死亡的胚多因创伤或细菌污染所致，且病毒还没有大量繁殖，故弃去不用。24 h 以后死亡的鸡胚随时取出放置于2 ～8 ℃冷库冷冻12 ～24 h，当中如有胚体发黑的死胚也弃去不要，因为这些鸡胚往往可能是内部发生了污染而致死。接种后的死胚通过照蛋灯可观察到蛋体发白、发亮，血管很少、断裂或是消失，依稀可见的血管也很纤细。活胚则胚体发红，蛋体布满血管，还可见到胚动。照蛋的照蛋灯要消毒，使用时动作要轻盈，避免弄破蛋壳，如有蛋壳破裂严重的也弃之不要。照完蛋后，要及时地将活胚蛋运回孵化机内继续进行孵育，至72 h后，将所有死胚与活胚分别标记，全部气室向上直立，放置于2 ～8 ℃冷库冷冻12 ～24 h。冷冻能够使鸡胚被冻死，使血管萎缩，利于尿囊液的收取，且避免收获时流出的血液与尿囊液发生凝集，造成收获的重组禽流感病毒液的效价变低。

6 重组禽流感病毒液的收获

在收获前，所有的器具也要进行严格的灭菌和消毒，避免造成污染。重组禽流感病毒液的收获主要是收取鸡胚的尿囊液。

6.1 鸡胚尿囊液的手工收获

将已经冻好的鸡胚从冷库中取出，用5%的碘酊擦拭蛋壳整个气室部位，然后再用75%的酒精进行脱碘。用消毒好的剪刀小心翼翼地剪去气室部位的蛋壳。注意不要让蛋壳掉入气室中。气室打开后，用无菌眼科镊子慢慢撕去卵壳膜，然后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起，用吸管刺破绒毛尿膜直接吸取尿囊液。为防止羊膜堵住吸管口，可用镊子轻轻压下羊膜及胎膜，然后再吸。收获完毕后，将收获好的禽流感病毒液放置2 ～8 ℃的环境下保存，以备浓缩灭活用。剪蛋壳时尽可能保证气室端的剪口平滑，且不要将壳膜剪破。挑取胚膜时，不能碰到鸡胚或尿囊液。收获时，如发现胎儿腐败、胚液混浊及有可疑污染的，则不要收获。收获时的顺序为从左到右，从下往上，手及用具不能从已剪过蛋壳且未收获的鸡胚上方经过。收获尿囊液时不能刺破卵黄，避免吸取到卵黄和蛋清。收获到合格的重组禽流感病毒液应该是颜色橙黄清亮且无污染。

6.2 用收获机对鸡胚尿囊液进行收获

在大规模生产中往往采用全自动的收获机对鸡胚里的尿囊液进行收获。使用全自动收获机进行收获主要控制的要点是：①收获前消毒灭菌处理到位。②根据蛋的大小调节收获机头的高度。若收获机头高度过高容易造成收获不干净，造成浪费，如若收获机头高度过低容易在收获时吸取到大量的蛋黄液，严重影响病毒液的品质。③要时时观察收获机头是否插到位，蛋盘的位置是否到位。④蛋消毒装置也要时时监控，保证鸡胚消毒到位。⑤收获到的病毒液要及时地转至2 ～8 ℃的环境中保存以备浓缩灭活用，⑥死胚蛋不适合用机器进行收获。