醋酸氯己定冲洗剂细菌内毒素检查法研究*

黄 婧，白玲玲，王 婷，苏 华，王银娟

（中国人民解放军东部战区总医院药剂科，江苏 南京210002）

醋酸氯己定冲洗剂为我院院内制剂［南制字（2016）B501008］，具有消毒、防腐作用，用于创面消毒和冲洗伤口。主要成分为双胍类化合物醋酸氯己定，通过吸附在细菌胞浆膜使细胞内容物漏出而起到抑菌和杀菌作用，对革兰阴性菌和阳性菌均有很强的抑制作用［1-2］。该品种收录于《中国人民解放军医疗机构制剂规范（2015年版）》［3］中，曾用名为醋酸洗必泰溶液。根据2015年版《中国药典（四部）》通则0128［4］25-26规定，冲洗剂需要进行细菌内毒素检查。醋酸氯己定冲洗剂在细菌内毒素检查中存在干扰，用稀释法无法消除［5］。本研究中采用二价离子补充剂稀释剂Ⅰ稀释样品以消除干扰，建立了醋酸氯己定冲洗剂的细菌内毒素检查方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ET-96型内毒素注射用水（BET）细菌内毒素检测仪（天津药典标准仪器厂）；HG71-A型恒温干燥箱（北京试验设备厂）；使用的器具、玻璃量器等均按2015年版《中国药典（四部）》规定除去可能存在的外源性内毒素。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，规格为每支80 EU，批号为150601-201681）；鲎试剂1［标 示 灵 敏 度（λ）为0.25 EU/mL，批 号 为1803231］，鲎试剂2（λ为0.06 EU/mL，批号分别为1803052，1804180），细菌BET（规格为每支5 mL，批号为1606160），稀释剂Ⅰ（规格为每支4 mL，批号为1803130），均购自安度斯生物有限公司；鲎试剂3（λ为0.25EU/mL，批号为1801230），鲎试剂4（λ为0.06EU/mL，批号分别为1806290，1807241），均购自博康海洋生物有限公司；醋酸氯己定冲洗剂（医院制剂，规格为每瓶500 mL，批号分别为180309，180529，180704）。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验

按2015年版《中国药典（四部）》通则1143［4］154-157细菌内毒素检查法复核鲎试剂标示灵敏度，结果鲎试剂灵敏度均在［0.5λ，2λ］范围内，符合要求。详见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果Tab.1 The results of TAL sensitivity test

2.2 细菌内毒素限值（L）和最大有效稀释倍数（MVD）的确定

L：参照2015年版《中国药典(四部)》通则0128冲洗剂项下规定，每1 mL中含细菌内毒素的量应小于0.50 EU［4］25-26。因此，将醋酸氯己定冲洗剂的L控制在0.5 EU/mL内。

MVD：目前市售鲎试剂的λ范围为0.03～0.5 EU/mL，按公式MVD=cL/λ（式中，c为供试品溶液的浓度，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）计算，对应的有效稀释倍数为0倍、2倍、4倍、8倍、16倍。结果显示，0倍、2倍、4倍稀释液对鲎试剂凝集反应有干扰，故选择在16倍有效稀释范围内对其进行细菌内毒素检测的干扰预试验。

2.3 干扰预试验

预试验1（BET稀释）：取样品(批号为180309)，分别用BET稀释2倍、4倍和8倍，作为供试品阴性对照（NPC）；各稀释倍数溶液中分别加入2λ内毒素（0.5 EU/mL），作为供试品阳性对照（PPC）。取2个厂家的鲎试剂（λ为0.25 EU/mL）分别与NPC、PPC溶液反应；将鲎试剂设为阳性对照（PC），BET设为阴性对照（NC）分别进行试验。结果见表2。可见，稀释的醋酸氯己定冲洗剂对鲎试剂凝集反应均有抑制作用，即供试品均存在干扰。

表2 干扰预试验1结果Tab.2 The results of preliminary interference testⅠ

预试验2（稀释剂Ⅰ结合BET稀释）：用稀释剂Ⅰ将样品(批号为180309)稀释2倍后，再用BET分别稀释4倍和8倍，作为NPC溶液；各稀释倍数溶液中分别加入2λ内毒素（0.5 EU/mL），作为PPC溶液。取2个厂家的鲎试剂（λ为0.25 EU/mL）分别与NPC、PPC溶液反应，并按常规设PC和NC。结果见表3。可见，稀释2倍的样品对鲎试剂凝集反应均无抑制作用，即样品2倍稀释液中不存在鲎试剂干扰。

表3 干扰预试验2结果Tab.3 The results of preliminary interference testⅡ

2.4 干扰试验

根据预试验结果，对样品分别稀释2倍、4倍、8倍，进行鲎试剂干扰试验。结果显示，2倍、4倍稀释液中均存在干扰，故选取8倍稀释液进行试验。取样品3批，分别用稀释剂Ⅰ稀释2倍后，再用BET稀释，最终为8倍稀释液，作为NPC溶液，用8倍稀释的供试品溶液及BET分别稀释细菌内毒素工作标准品，制成2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的溶液。同时使用2个不同厂家的鲎试剂（λ为0.06 EU/mL），按2015年版《中国药典（四部）》通则1143细菌内毒素检查法凝胶法［4］154-157进行干扰试验，结果见表4。可见，将样品使用稀释剂Ⅰ、BET稀释8倍时，对不同批号的鲎试剂与细胞内毒素工作标准品反应均无干扰作用。

2.5 标准建立

取本品，使用稀释剂Ⅰ对样品稀释2倍，再用BET对上述溶液进行稀释，最终得到稀释8倍的供试品溶液；取上述供试品溶液及BET分别将细菌内毒素工作标准品制成2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的溶液，使用λ为0.06 EU/mL的鲎试剂，根据2015年版《中国药典（四部）》通则1143检测供试品溶液中细菌内毒素的含量，每1 mL供试品溶液中细菌内毒素含量应小于0.5 EU［4］154-157。

表4 样品细菌内毒素干扰试验结果Tab.4 Results of bacterial endotoxin interference test of the samples

2.6 样品检测

取λ为0.06 EU/mL的鲎试剂，按本研究中拟建立的细菌内毒素检查方法对3批样品进行常规检查，结果均呈阳性反应。详见表5。

表5 样品细菌内毒素检查结果Tab.5 The results of bacterial endotoxin test for the samples

3 讨论

3.1 细菌内毒素检查方法

细菌内毒素检查方法具有试验条件要求低、检测速度快、重复性佳、结果精准等优点［6-7］。在2015年版《中国药典（四部）》附录中收载的细菌内毒素检查方法有凝胶法和光度测定法［4］154-157。其中，凝胶法操作简便，是限量试验，主要为检验机构判定供试品L是否合格的检验手段；光度测定法是定量试验，主要用于药品生产企业定量测定供试品中含有的L，以提高生产质量［8-9］。故本研究中选用凝胶法。

3.2 稀释溶剂

醋酸氯己定冲洗剂对鲎试剂细菌内毒素凝集反应有抑制作用［5］，使用BET稀释无法消除干扰，而使用稀释剂Ⅰ作为辅助稀释，可消除干扰［10］。醋酸氯己定冲洗剂主要成分醋酸氯己定含有醋酸根离子，可能与鲎试剂中的单价和二价离子发生反应，而鲎试剂中的单价和二价离子是保持灵敏度的必需成分，故直接使用BET稀释会抑制鲎试剂与内毒素的反应能力。本研究中选用的稀释剂Ⅰ为含有一定浓度的二价离子，可饱和醋酸根离子，维持鲎试剂的正常灵敏度［11］。

为了节省检验成本，本研究中考察了最佳稀释方法。结果表明，只要在第一步稀释样品时加入稀释剂Ⅰ稀释，以后步骤用BET稀释即可排除干扰。

3.3 稀释倍数

预试验中2倍稀释即无干扰，但正式干扰试验中，2倍稀释及4倍稀释液中分别加入细菌内毒素工作标准品制成1λ，0.5λ，0.25λ的PPC溶液时，与鲎试剂反应均为阴性，故最终选取稀释倍数为8倍。

3.4 方法评价

本研究中建立的方法可用于醋酸氯己定冲洗剂细菌内毒素的检查，为可能导致鲎试剂中单价和二价离子缺失样品的细菌内毒素检查方法的建立提供参考。