妊娠合并甲状腺功能减退对婴儿出生后1个月肠道菌群的影响

马啸，丁娟，任志刚，李臻，韩丽萍，禚志红，赵先兰

(郑州大学第一附属医院 质量控制处，河南 郑州 450052)

甲状腺功能减退是产妇妊娠期常见并发症。甲状腺功能减退增加不良妊娠结局风险[1]，影响胎儿神经系统发育[2]，还可能通过影响后代肠道菌群从而导致疾病的发生。婴儿期肠道菌群的定植和建立与婴儿的生长发育、营养状况及免疫系统的成熟密切相关[3-6]。目前有关妊娠合并甲状腺功能减退对子代肠道菌群定植影响的基础研究报道较少。本研究拟采用16S rRNA测序技术，分析妊娠合并甲状腺功能减退孕妇所生婴儿出生后1个月肠道菌群与产前检查无并发症孕妇所生婴儿出生后1个月肠道菌群的差异，了解妊娠合并甲状腺功能减退对子代肠道菌群定植的影响，为胎儿娩出后接受益生菌干预，从而减少其对子代远期的影响提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年7月至2018年8月郑州大学第一附属医院收治的孕妇孕期产检诊断合并甲状腺功能减退、足月出生的7例婴儿为观察组，入组孕妇和婴儿无其他并发症，妊娠甲状腺功能减退孕妇接受统一的内科治疗。根据观察组婴儿的分娩方式和喂养方式进行1∶1配对选取同期孕妇产前检查无并发症、足月出生的7例婴儿作为对照组。妊娠合并甲状腺功能减退的诊断：参照2019年中华医学会内分泌学分会和中华医学会围产医学分会制定的《妊娠和产后甲状腺疾病诊治指南》[7]推荐的标准进行诊断。入选标准：出生胎龄为37～42周；出生体质量为2 500～4 000 g。排除标准：妊娠前有确诊的甲状腺疾病史；严重心、肝、肾等疾病；孕期合并严重高血压、糖尿病。婴儿父母自愿参与本研究并签署知情同意书。本研究经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1临床信息收集 查阅郑州大学第一附属医院电子病历系统，收集两组婴儿性别、胎龄、出生体质量、孕妇孕期体质量增长、孕妇产前体质量指数(body mass index，BMI)等临床资料。

1.2.2标本采集 收集婴儿出生后1个月的粪便标本。用采样器采集2～3 g新鲜粪便，置于无菌粪便盒内，使用液氮罐转运至实验室，置于-80 ℃冰箱保存待检。

1.2.3粪便DNA提取、扩增和高通量测序 采用化学裂解法裂解粪便样本细胞膜及细胞核膜，提取标本的总DNA，以每份粪便样本提取的DNA为模板，采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)特异性扩增16SrRNA基因的V3～V4区域。正向引物：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’。反向引物：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。不同样本的PCR产物按相同比例进行混合，于Illumina Miseq平台进行高通量测序。

1.2.4生物信息学分析 在门水平和属水平进行丰度分析，比较每个细菌类群相对水平的差异。另采用线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)效应值(LDA effect size，LEfSe)方法来确定观察组婴儿出生后1个月特有的肠道微生物特征，LDA>3为差异有统计学意义。计算样品多样性如Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数及ACE指数，并比较两组的差异性。多样性分析用于比较两组菌群结构的差异，主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)中样本距离越接近，表示菌群结构越接近。对群落差异进行Adonis分析，R2表示不同分组对样品差异的解释度，R2越大表示分组对差异的解释度越高。通过置换检验获得P值，P值越小，表明组间差异越显著。

2 结果

2.1 一般情况两组婴儿性别、胎龄、出生体质量、孕妇孕期体质量增长、孕妇产前BMI、分娩方式、喂养方式比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 16S rRNA测序结果通过对两组粪便样本进行高通量测序后，共得到466 900条有效序列，基于有效序列以超过97%相似性进行OTUs聚类，共注释到1 099个OTUs。分析两组间共有、特有的OTUs，绘制成韦恩图。见图1。

2.3 婴儿出生后1个月肠道菌群门水平结构分布两组主要的菌门有厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。见图2A。两组放线菌门和蓝细菌门丰度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2B。

图1 基于OUTs的韦恩图

A为婴儿出生后1个月肠道菌群门水平丰度；B为婴儿出生后1个月肠道菌群门水平差异菌。

2.4 婴儿出生后1个月肠道菌群属水平结构分布两组主要的菌属主要有链球菌属、克雷伯菌属、双歧杆菌属、埃希菌-志贺菌属、拟杆菌属、韦荣球菌属、乳杆菌属、狭义梭菌属、副杆菌属和葡萄球菌属。见图3A。两组双歧杆菌属和韦荣球菌属丰度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3B。

A为婴儿出生后1个月肠道菌群属水平丰度；B为婴儿出生后1个月肠道菌群属水平差异菌。

2.5 婴儿出生后1个月肠道菌群LEfSe分析采用非参数因子秩和检验检测具有显著丰度差异的特征，找到与丰度有显著性差异的类群，采用LDA估算每个物种丰度对差异效果的影响。以LDA>3为标准筛选本次分析中的特征性差异菌。见图4。

2.6 婴儿出生后1个月肠道菌群与多样性观察组和对照组肠道菌群多样性Shannon指数分别为(2.25±0.07)和(2.03±0.21)，Simpson指数分别为(0.17±0.01)和(0.23±0.04)，Chao1指数分别为(109.94±13.22)和(101.67±12.91)，ACE指数分别为(121.02±13.59)和(104.01±12.58)，两组各指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。多样性分析中，PCoA结果显示两组肠道菌群结构接近。见图6。Adonis分析显示两组肠道菌群结构差异无统计学意义(R2=0.081，P=0.372)。

图4 婴儿出生后1个月肠道菌群LEfSe分析

A为Shannon指数；B为Simpson指数；C为Chao1指数；D为ACE指数。

图6 两组婴儿出生后1个月肠道菌群PCoA结果

3 讨论

肠道菌群的定植影响婴儿的生长发育和健康状况，与成年后肥胖[8-9]、糖尿病[5,10]等的发生密切相关。此外，肠道菌群还可通过肠黏膜免疫、内分泌和迷走神经途径参与脑-肠轴活动，影响大脑功能及其与大脑关联的一些宿主行为，如焦虑、 抑郁等[11-12]。母亲是婴儿生命早期菌群定植的主要来源，分娩方式[13-14]、 喂养方式[14-15]等因素均会影响婴儿的肠道菌群组成、丰度及分布情况。研究表明，母亲孕期的糖脂代谢水平与婴儿肠道菌群的组成和结构密切相关[16]。Collado等[17]研究发现，16例孕前肥胖孕妇的子代出生后6个月拟杆菌属、葡萄球菌属数量显著多于26例孕前体质量正常孕妇的子代。既往研究表明孕妇妊娠合并甲状腺功能减退与脂肪、糖类代谢密切相关[18-19]。本研究首次报道了孕妇妊娠合并甲状腺功能减退影响婴儿早期肠道菌群的定植和形成，提示妊娠合并甲状腺功能减退是影响婴儿肠道菌群的重要因素。

本研究结果显示，肠道菌群在妊娠合并甲状腺功能减退孕妇所生婴儿中变化显著，两组肠道菌群结构存在差异，不同菌属存在丰度差异。本研究对两组婴儿粪便样本中微生物的多样性进行了初步分析，发现两组肠道菌群多样性差异无统计学意义，这表明两组婴儿微生物群落的丰度和多样性无明显差异。两组粪便中优势菌群以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门为主，但具体到属的水平上则出现较大的个体差异性。观察组双歧杆菌属丰度低于对照组。双歧杆菌属是母乳喂养婴儿肠道内的优势菌，其作为肠道中常见的有益菌，在维持肠道功能平衡、保证宿主正常的新陈代谢等方面发挥着重要的作用[20]。双歧杆菌属减少所引起的肠道菌群失调会导致许多代谢性疾病的发生。有研究发现，双歧杆菌属可以有效改善糖类代谢，降低高脂饮食诱导的糖尿病小鼠的内毒素水平，减轻肠道炎症[21-22]。同时，观察组肠道菌群中韦荣球菌属丰度高于对照组。韦荣球菌属是革兰阴性厌氧微小球菌，属于厚壁菌门，是重要的条件致病菌[23]，参与构成人类口腔、泌尿生殖器、呼吸道及肠道内的正常菌群组成，易导致龋齿、脑膜炎、硬膜外积液、心内膜炎等疾病[24-26]。两组婴儿在肠道菌群组成上存在较大差异。

妊娠合并甲状腺功能减退可影响婴儿出生后1个月肠道菌群，这可能是引起子代肠道菌群紊乱的原因。目前对妊娠合并甲状腺功能减退孕妇所生婴儿早期肠道菌群定植的研究相对较少。本研究对妊娠合并甲状腺功能减退孕妇所生婴儿出生后1个月的肠道菌群进行分析，加深了对婴儿期肠道菌群定植的认识，为深入了解婴儿肠道菌群的早期定植奠定了基础，同时为防治婴儿肠道菌群紊乱提供了新的着眼点，为胎儿娩出后接受益生菌干预，从而降低孕妇妊娠合并甲状腺功能减退对子代远期的影响提供参考依据。