DIAPH3基因在肺腺癌中的表达及其对患者生存预后的影响

赵畅，黄凤祥，刘盈，彭强，张鑫烨，李瑞喆，苗丽君

(郑州大学第一附属医院 a.呼吸与危重症二科;b.胸外科;c.病理科，河南 郑州 450000)

肺腺癌是肺癌最常见的类型，约占肺癌的40%[1]，是导致患者高病死率的恶性肿瘤之一。虽然对其发生发展的分子学机制方面的了解有了一定的进展，并在临床治疗方法上取得了一些进步，但常规放疗和化疗仍无法突破当前治疗的瓶颈。因此寻找可能参与肺腺癌发生发展的驱动基因是肺癌基础及临床研究的当务之急。DIAPH3基因位于人类13号常染色体长臂2区1带，其产物属于Formin蛋白家族。该蛋白可参与肌动蛋白的重塑、细胞形态的变化、运动和黏附的调节等生理活动[2-3]。多项研究表明DIAPH3基因的表达量与听神经系统疾病和硅肺相关[4-5]，与乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌等肿瘤的发生与转移有关[3,6-10]。Guo等[11]发现DIAPH3是肺腺癌中的上调基因并促进肺腺癌细胞的生长。DIAPH3在肺癌中的研究较少，本文通过分析DIAPH3在癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库及临床标本中的表达情况，以期对肿瘤预后的判断及临床治疗方案的制定起到一定的参考作用。

1 资料与方法

1.1 TCGA数据库中DIAPH3mRNA表达水平及相关临床数据通过TCGA数据库获得肺腺癌患者DIAPH3mRNA表达水平及相关临床数据，共495例原发性肺腺癌患者，其中328例记录了完整数据。根据DIAPH3mRNA表达水平将肺腺癌患者分为DIAPH3mRNA低表达组(表达量低于8.152 FPKM)和mRNA高表达组(表达量高于8.152 FPKM)，进行后续分析。

1.2 肺腺癌患者临床标本收集2015年1—12月郑州大学第一附属医院胸外科术后肺腺癌组织和癌旁组织(距癌周>5 cm)标本。纳入标准：(1)组织学病理确诊为肺腺癌，病理结果由两名中级以上职称病理科医生复核；(2)有详细的随访信息；(3)无其他恶性肿瘤病史；(4)手术前未接受化疗、免疫治疗和放疗。排除标准：(1)其他肺部疾病；(2)疾病发生进展过程中伴有新生血管的疾病，如糖尿病等；(3)孕期或哺乳期。最终纳入55例肺腺癌术后石蜡病理切片标本和26例癌旁组织标本。肺癌标本中男26例，女29例，年龄44～77岁，按照第8版国际抗癌联盟肺癌TNM分期标准进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期17例。

1.3 免疫组化对石蜡切片进行脱蜡和水化处理，使用枸橼酸钠修复抗原后用H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶活性，以BSA溶液封闭，血清封闭后孵育一抗、二抗。显色、复染、脱水、封固后于镜下观察DIAPH3蛋白表达情况并选取视野拍照。免疫组化结果判读：由两名经验丰富的病理科医生采用统一标准，根据DIAPH3蛋白染色的强度和阳性细胞数占比对结果进行判读。(1)细胞着色的强度：细胞不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分。(2)着色细胞占比：着色细胞计数>0%～5%为0分；着色细胞计数>5%～25%为1分；着色细胞计数>25%～50%为2分；着色细胞计数>50%～<100%为3分。(3)计分：每张片子的平均着色程度得分乘以平均着色细胞占比得分，0～1分判定为阴性，记为等级0；2～3分判定为弱阳性，记为等级1；4～6分判定为中度阳性，记为等级2；>6分判定为强阳性，记为等级3。本研究中取免疫组化评分等级0～1设为DIAPH3蛋白低表达组，等级2～3设为DIAPH3蛋白高表达组。

1.4 随访开始于2015年1月，截止至2020年11月，获得患者的总生存期(overall survival，OS)。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。以log-rank法分析DIAPH3表达水平与肺腺癌患者预后的关系，以χ2检验分析DIAPH3蛋白表达情况，以单因素和多因素 Cox回归分析影响患者预后的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据结果

2.1.1DIAPH3mRNA表达情况与肺腺癌患者预后的关系DIAPH3mRNA低表达的肺腺癌患者的总生存率高于DIAPH3mRNA高表达的肺腺癌患者(P<0.05)。见图1。

图1 DIAPH3 mRNA表达情况与肺腺癌患者预后的关系

2.1.2Cox单因素回归DIAPH3mRNA表达水平、T分期、N分期、临床分期与5 a生存率相关(P<0.05)，与年龄、性别、M分期无关(P>0.05)。见表1。

2.1.3Cox多因素回归 将单因素分析中有统计学意义的DIAPH3mRNA表达水平、T分期、N分期和临床分期纳入Cox多因素回归分析，发现DIAPH3mRNA高表达、N1～3期、临床分期Ⅲ～Ⅳ期是肺腺癌患者OS的影响因素(P<0.05)，T分期不是OS的影响因素(P>0.05)。见表2。

2.2 临床标本结果

2.2.1DIAPH3蛋白在肺腺癌组织中表达情况 免疫组化发现DIAPH3蛋白在肺腺癌及癌旁组织中表达，定位在细胞质中。结果表明，腺癌组织DIAPH3蛋白表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。见表3。

2.2.2DIAPH3蛋白表达情况与肺腺癌患者预后的关系 DIAPH3蛋白低表达的肺腺癌患者的总生存率高于DIAPH3蛋白高表达的肺腺癌患者(P<0.05)。见图2。

表1 TCGA中肺腺癌患者5 a生存率的单因素分析(n，%)

表2 TCGA中肺腺癌患者OS的多因素分析

表3 DIAPH3蛋白在肺腺癌及癌旁组织中的表达 水平比较[n(%)]

图2 DIAPH3蛋白表达情况与肺腺癌患者预后的关系

2.2.3Cox单因素回归 DIAPH3蛋白表达水平、N分期以及临床分期与5 a生存率相关(P<0.05)，年龄、性别、T分期、M分期与5 a生存率无关(P>0.05)。见表4。

表4 肺腺癌患者5 a生存率的单因素分析(n，%)

2.2.4Cox多因素回归 将单因素分析中有统计学意义的DIAPH3蛋白表达水平、N分期和临床分期纳入Cox多因素回归分析，发现DIAPH3蛋白高表达、临床分期Ⅲ～Ⅳ期是肺腺癌患者OS的影响因素(P<0.05)。见表5。

表5 肺腺癌患者OS的多因素分析

3 讨论

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一[12]。随着靶向治疗及免疫治疗的不断开展与进步，非小细胞肺癌已迈入“个体化治疗”和“精准治疗”的新时代，越来越多的肺腺癌驱动基因被发现，为肿瘤的治疗提供潜在靶点[13-15]。DIAPH3在多种肿瘤侵袭和转移中也扮演重要角色，它可以通过改变微管稳定性影响细胞骨架进而影响细胞的阿米巴表型[2]，具有阿米巴表型的肿瘤细胞通过改变自身形状更易穿过周围组织发生转移。

本研究收集了TCGA数据库的495例原发性肺腺癌患者的DIAPH3mRNA表达情况及临床数据，纳入55例临床肺腺癌术后石蜡病理切片标本及26例癌旁组织标本。对55例肺腺癌患者的癌组织和癌旁组织进行免疫组化染色发现，DIAPH3在肺腺癌组织的细胞质中阳性率高于癌旁组织。研究发现DIAPH3mRNA在胰腺癌组织中高表达，免疫组化染色呈强表达[16]。Guo等[11]研究也发现肺腺癌细胞系中DIAPH3蛋白较正常支气管细胞表达高，与本研究结果一致。DIAPH3在肺腺癌疾病诊断和治疗中具有一定的研究价值和应用价值，可能促进肺腺癌的发生。

关于DIAPH3基因对肺腺癌患者生存预后的影响，本研究发现DIAPH3mRNA或蛋白高表达的肺腺癌患者预后更差，高表达患者的总生存率低于低表达患者。这与Nishida等[16]研究发现DIAPH3高表达的胰腺癌患者的OS更短一致，可能与DIAPH3参与肌动蛋白重塑和调节细胞运动、黏附，导致恶性肿瘤的侵袭或转移引起的预后不良有关。因此，DIAPH3基因有望成为肺腺癌肿瘤诊断和预后预测的新的生物标志物，并可作为肺腺癌治疗的潜在分子靶点。

为进一步分析影响肺腺癌预后的因素，本研究纳入年龄、性别、DIAPH3表达情况、临床病理特征等数据，探讨患者OS的危险因素。TCGA结果显示，DIAPH3mRNA表达水平、T分期、N分期、临床分期与5 a生存率相关，临床结果显示，DIAPH3蛋白表达水平、N分期和临床分期与5 a生存率相关。DIAPH3mRNA或蛋白高表达、临床分期Ⅲ～Ⅳ期是患者OS的影响因素。在临床上肿瘤T、N、M分期是影响患者生存的重要因素，但在本研究中临床患者的部分指标差异无统计学意义，可能与临床患者未能及时获得治疗、样本数据量过小、混杂因素较多有关。此外，本研究为回顾性研究，对不同干预措施的效果未进行分析，尚需开展前瞻性研究进一步确定，能否将DIAPH3基因作为肺腺癌新的预后标志物仍需要进一步验证。

综上所述，本研究通过TCGA数据库、临床患者免疫组化实验研究DIAPH3基因在肺腺癌中的表达情况，并对患者临床特征及预后进行分析，发现临床标本中肺腺癌组织的DIAPH3蛋白表达水平较癌旁组织高，DIAPH3mRNA或蛋白水平高表达和临床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者的预后更差，是OS的影响因素，提示DIAPH3基因可能参与肺腺癌的发生发展，DIAPH3基因有望成为肺腺癌诊断和预测预后的新的生物标志物，并可作为肺腺癌治疗的潜在分子靶点。