基于气相色谱-离子迁移谱对百里香挥发性成分的分析

刘娟，赵欢蕊，付咪咪，段义忠

(榆林学院 生命科学学院，陕西 榆林 719000)

百里香又名麝草香，属双子叶唇形科芳香植物，是一种株型奇特矮小的亚灌木，花冠紫红,色泽艳丽，于盛花期间散发特有的麝香香味，香味独特,回味悠长，因其特有的芳香气味，自古以来作为一味重要的调味品被广泛应用于食物烹调，在西方国家尤为流行[1]。作为一种中西方应用历史已久的香料植物，干燥的百里香粉或叶片可用于制作调味香料，被加入到牛羊肉等肉类的制作中用以除膻、提香，使肉汤汤鲜味美，食之令人食欲大增，因此深受消费者的喜爱[2-5]。除了具有浓郁的芳香气味外，百里香还具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗衰老、美容养颜等功效，其中挥发性化合物被认为是其发挥生理功效的关键物质，其主要提取物百里香酚、香荆芥酚具有较强的杀菌、防腐及抗氧化等活性，被广泛应用于食品添加剂、药品等行业[6-9]。

气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)联用技术是利用气相离子的电场迁移速率差异进而对离子进行分析鉴定，集合了气相色谱高分离度和离子迁移谱高分辨、高灵敏等优点，特别适用于挥发性有机化合物的痕量检测[10]。与传统的气质联用技术相比，GC-IMS技术对样品处理及分析的温度更低，更利于热稳定性较差的挥发性化合物的检出，其次，气相离子在经过气相色谱的初步分离后，在离子迁移谱中实现了进一步的分离，其分离能力较普通色谱更强，此外，还具有仪器体积小便于携带、常压工作后期维护成本低等多重优势，因此，气相离子迁移谱技术在食品挥发性物质的检测、食品质量把控等领域具有较好的应用前景。

百里香挥发性成分含量低、组成复杂、易挥发、不稳定，现有的分离与检测技术还存在着各种各样的限制，而利用GC-IMS技术对百里香挥发性成分分析的研究鲜有报道，因此，本研究选取GC-IMS联用技术对百里香中的挥发性成分进行分析研究，旨在为百里香资源的进一步开发利用提供理论依据，也为快速、高效分析百里香挥发性化合物拓宽了思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

百里香：于2019年5～9月间取自陕西榆林卧云山地区。标准对照品：麝香草酚(thymol)纯度>99%，批号100508-200301，中国药品生物制品检定所；香荆芥酚(carvacrol)纯度>98%，批号2078896，上海瑞楚生物科技有限公司；无水乙醇(色谱纯)：天津四友精细化学品有限公司；水为超纯水。

CTC Combi-PAL自动顶空进样器 丹麦Densensor公司；Flavour Spec气相色谱-离子迁移谱联用仪：配有Laboratory Analytical Viewer (LAV)分析软件及GC-IMS Library Search定性软件(内置NIST 2014保留指数数据库和G.A.S.漂移时间数据库) 德国 G.A.S公司。

1.2 试验方法

1.2.1 百里香样品的制备

将采摘的百里香全草，去除根、茎秆后，人工将百里香花、叶进行分离，阴干备用。百里香花期较短，根据采摘时间的不同将样品分为F1采收期(5月20日采摘)和F2采收期(6月20日采摘)，样品编号为F1和F2。百里香叶片则根据采摘时间的不同分为L1采收期(5月20日采摘)、L2采收期(6月20日采摘)、L3采收期(7月22日采摘)、L4采收期(8月23日采摘)，样品编号分别为L1、L2、L3和L4。

1.2.2 顶空萃取条件

顶空进样体积：100 μL；孵育时间：15 min；孵育温度：40 ℃；进样针温度：45 ℃；孵化转速：500 r/min。

1.2.3 GC-IMS技术分析条件

色谱柱类型：FS-SE-54-CB-1(15 m, ID:0.53 mm)，色谱柱柱温60 ℃，载气/漂移气：高纯氮气(纯度≥99.999%)，载气流速：E1(漂移气流速)为150 mL/min，E2(气相载气流速)为初始2 mL/min，2 min内保持不变，2 min后增至100 mL/min，保持100 mL/min直至分析结束。IMS内置放射源：β射线(氚，3H)；漂移电压：5 kV，漂移管长度：98 mm，管内线性电压500 V/cm，漂移管温度45 ℃，漂移气：高纯氮气(纯度≥99.999%)，漂移气流速150 mL/min，离子化模式：正离子。GC-IMS检测分析时间：40 min。

1.2.4 GC-IMS技术检测方法

每份样品0.5 g，分别做3次平行试验，置于20 mL顶空瓶中，使用加热的进样针抽取瓶内的顶空组分，通过Flavour Spec气相色谱-离子迁移谱仪进行分析。

1.2.5 GC-IMS技术定性定量分析

1.2.5.1 定性分析

通过仪器内置NIST数据库和IMS数据库进行定性分析。利用Matlab R2014a进行主成分分析(principal component analysis， PCA)。挥发性物质的气相色谱-离子迁移图谱和指纹图谱采用Reporter和Gallery插件程序绘制，标准曲线采用LAV分析软件绘制，表格采用Excel制作。

1.2.5.2 定量分析

通过G.A.S公司开发的LAV分析软件进行百里香样品的定量分析。采用外标法对被分析物质绘制Boltzmann函数标准曲线，根据分析物标准对照品浓度反推该分析物在百里香样品中的浓度，完成定量。定量方法：分别称取适量标准对照品于棕色容量瓶中，配制1000 mg/L 的标准储备液，于4 ℃保存。分别称取适量标准储备液，以70%乙醇水溶液(V/V)定容，配制浓度分别为0.54，5.37，10.75，21.50，42.99，85.99 mg/L 的标准工作溶液，于4 ℃保存，通过气相色谱-离子迁移谱仪测定不同浓度标准对照品的离子峰强度，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 百里香挥发性成分定性分析

对百里香花、叶进行挥发性物质定性分析，共检测出72种挥发性物质，以仪器内置的NIST气相保留指数数据库与IMS迁移时间数据库资料共定性识别出36种挥发性成分，包括醇类8种、醛类6种、酮类6种、萜类及其衍生物6种、酯类5种、酸类3种和杂环类物质2种，结果见表1。

表1 百里香样品挥发性成分的定性Table 1 The characterization of volatile components in Thymus vulgaris samples

2.2 百里香样品的气相色谱-离子迁移指纹图谱

为了更直观地表现百里香花、叶在不同采收时期挥发性物质种类及浓度差异的动态变化，对所有样品挥发性成分中已定性组分绘制气相色谱-离子迁移指纹图谱，见图1。可以看出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰(每个样品3次平行)，图中每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰。其中，颜色代表物质的浓度，颜色越深表示浓度越大。

图1 百里香已定性挥发性成分的气相色谱-离子迁移指纹图谱Fig.1 The GC-IMS of volatile components identified in Thymus vulgaris

对比全部样品的指纹图谱，由图1可知，不同采收期百里香花朵、叶挥发性物质的种类基本相似，但一些挥发性物质的浓度差异明显，且呈现一定变化规律。叶中的挥发性物质种类及浓度要普遍高于花朵中，而不同采收期的花朵之间以及叶之间的挥发性物质种类及浓度也存在较大差异。图1中A区域所示的挥发性物质为百里香花朵、叶中普遍存在的物质，在不同的花朵及叶样品中的浓度较为相近，没有明显的分布特征，主要是一些醇类、醛类以及少量酯类物质。而图中B区域所示的挥发性物质则主要在百里香叶中分布，且其在叶样品中的浓度普遍高于花朵中，比较典型的是一些萜类及其衍生物，如柠檬烯、芳樟醇、α-松油醇、γ-松油烯等。图中C区域所示的挥发性物质则主要分布在百里香花朵中，其在花朵样品中的浓度普遍高于叶中，主要涉及一些酮类物质，如环己酮、庚酮等。而2,3-丁二醇(已定性物质第4列)，见图中虚线框，在百里香花朵、叶中虽均检出，但其在F2(6月)采收花中的浓度明显高于F1(5月)采收的花朵，考虑这些挥发性物质可以作为区分百里香不同器官及相同器官不同采收期的特征物质。

2.3 百里香挥发性成分PCA分析

选取百里香全部样品中所有挥发性化合物的信号峰进行 PCA 分析，以检测样品间挥发性物质是否有显著性差异，结果见图 2。其中，PC1的贡献率为48%，PC2的贡献率为24%，二者累计贡献率高达72%，这说明通过主成分分析能够获取表征样品挥发性成分中的大部分信息。

图2 全部样品的PCA分析Fig.2 Principal component analysis of all samples

由图2可以直观看出样品之间的特征差异，百里香花朵样品和叶样品之间的距离较远，而花朵或者叶子样品彼此之间的距离相对近一些，但是仍然可以明显区分，这是因为花朵和叶的特征差异比较明显，且单个样品的重复性较好，可见，使用PCA分析可以准确区分百里香花朵和叶，也能够区分不同采收期的花朵和叶，这与指纹图谱的分析结果一致，这间接说明气相色谱-离子迁移谱技术在百里香掺假、质量鉴别等方面具有很好的应用潜力。

2.4 百里香挥发性成分定量分析

气相色谱-离子迁移谱技术除了可以对百里香样品中的挥发性物质进行定性分析、差异鉴别以外，还可以利用LAV分析软件对挥发性物质进行定量检测。已有研究表明，百里香酚和香荆芥酚是百里香挥发油中的主要成分[11]，《欧洲药典》中对百里香的同属植物中二者的含量有明确规定，要求二者在挥发油中的总和要高于40%，我国百里香质量标准中还没有对二者含量的具体要求，一些研究学者已建立了关于二者含量检测的方法以完善百里香的质量把控[12]。然而，基于GC-IMS对二者的定量分析鲜有报道，因此，本研究采用GS-IMS技术对百里香中的百里香酚和香荆芥酚进行定量分析，以期为百里香的质量标准研究提供一定数据支撑。

百里香酚和香荆芥酚二者为同分异构体，由于分子结构原因很难形成多聚体，此外，由于仪器的分离条件如分离柱类型、温度等因素所限，导致二者的峰重叠，无法分离，计算时只能通过二者的总峰强度计算二者总浓度。百里香酚GC-IMS标准曲线见图3，回归方程及检出浓度范围见表2。

图3 百里香酚GC-IMS标准曲线Fig.3 GC-IMS standard curve of thymol

表2 百里香酚的回归方程及检出浓度范围Table 2 The regression equations and detected concentration ranges of thymol

百里香样品中百里香酚的GC-IMS检出浓度见表3。

表3 样品中百里香酚的GC-IMS检出浓度Table 3 The concentration of thymol detected in Thymus vulgaris samples by GC-IMS

试验结果表明，百里香酚在百里香叶中的含量普遍高于其在花朵中的含量。在百里香花朵的发育过程中百里香酚的含量变化相对较小，盛花期花朵(F2)中百里香酚的含量略高于初花期的花朵(F1)，而在百里香叶的生长过程中百里香酚的含量变化较为明显，其中，5月份采摘的百里香叶(L1)中百里香酚含量最高，8月份采摘的百里香叶(L4)中百里香酚的含量最低。

裴香萍等[13]对山西榆社地区的百里香进行百里香酚含量检测，得出榆社地区6月份百里香中百里香酚的含量最高，本试验结论与之相似，推测可能是地域相近的原因所致。百里香花朵期较短，植株生长发育较快，本试验基于GC-IMS技术对百里香的主要挥发性成分进行定量分析，进一步深入探究了百里香不同采收期挥发性成分百里香酚的量变规律，为百里香原材料适采期的确定提供了数据支撑和理论依据，即对于陕西榆林地区百里香中百里香酚的利用，应以百里香叶为主，且最适采收期应为百里香的生长前期，即每年的5月份左右。

3 结论

本研究运用GC-IMS技术对百里香花、叶中的挥发性有机物分别进行定性分析、差异鉴别及定量检测。从百里香花、叶中共检测出72种挥发性物质，定性识别出36种挥发性成分，宋述芹等[14]利用顶空固相微萃取结合气质联用技术分别从百里香花朵和叶中鉴定出24种和14种挥发性成分，可见采用GC-IMS技术对百里香挥发性物质种类的分析更为适宜。通过GC-IMS技术建立不同采收期百里香花、叶中挥发性有机物的指纹信息模型库，为百里香加工原料适采期的确定提供了数据支撑及科学依据，也为快速、高效分析百里香中的挥发性化合物提供了一种新的可靠手段。