高氯酸非水滴定法测定酱油中氨基酸态氮含量可行性研究

汪静静，周小清

(泰州市药品检验院，江苏 泰州 225300)

酱油是中国传统的调味品。氨基酸态氮是酱油发酵程度的特性指标，也是影响酱油风味的重要因素。因此一定程度上，酱油中氨基酸态氮含量决定该酱油的质量等级[1]。国家强制标准[2]规定最低等级酱油中氨基酸态氮含量不得低于0.40 g/mL。因此，企业也在不断改善酱油中发酵工艺以获取高含量的氨基酸态氮，从而提高其商业价值。由于酿造工艺直接影响酱油中氨基酸的含量[3-7]，方便快捷、精确的氨基酸态氮测定方法对生产企业过程控制尤其重要。

目前酱油中氨基酸态氮的检测方法主要是依据国标GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》[8]中酸度计法和分光光度计法两种方法，其中酸度计法为仲裁法且最常用[9-10]，具体操作步骤：样品溶液先用氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH 8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，再加入甲醛以固定氨基酸中氨基的碱性，使羧基表现出酸性，再继续用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计指示pH 9.2确定终点。整个过程操作相对繁琐，影响测定结果准确性的因素较多[11-12]，且甲醛对皮肤黏膜有刺激作用[13-15]。

考虑到高氯酸作为含氧酸中最强酸，通常用于有机碱类物质含量的滴定[16-19]，而氨基酸本身亦属于有机碱类物质，理论上可以用高氯酸滴定。另外，现行GB 5009.43-2016《食品安全国家标准 味精中麸氨酸钠(谷氨酸钠)的测定》中新增加了高氯酸非水溶液滴定法测定味精中的谷氨酸钠，更是给了我们建立高氯酸非水溶液滴定法测定酱油中氨基酸态氮含量的信心。

本文利用氨基酸的两性作用，采用乙酸酐-乙酸体系溶解酱油，使酱油中氨基酸在乙酸酐-乙酸体系中酸性减弱而碱性大大提高，考察高氯酸标准滴定液滴定其氨基的可行性并建立初步方法。考察了该方法的重复性及加标回收率，并将该方法和酸度计法进行对比研究，以期为酱油生产和质量控制提供更多的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酱油：购于本地超市；酱油标准品：大连中实国实检测技术有限公司，含量为1.15 g/100 g；氢氧化钠标准溶液[C(NaOH)=0.0501 mol/L]；高氯酸标准溶液[C(HClO4)=0.1044 mol/L]。甲醛36%、醋酸、醋酸酐：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水为蒸馏水。

XS204电子分析天平、梅特勒托利多仪器公司；FE20酸度计 梅特勒-托利多仪器公司；C-MAG-HS7磁力加热搅拌器 IKA仪器公司；888全自动电位滴定仪+复合玻璃pH智能电极 瑞士万通公司。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器方法

空白测定采用等量滴定模式，最小加液体积为0.01 mL。样品测定采用等量滴定模式；加液速度为5 mL/min，搅拌速度为8 r/s，预搅拌时间为30 s，可接受信号漂移为50.0 mV/min。

1.2.2 样品测定

准确称取约0.5 g样品于滴定杯中，加2 mL醋酐和60 mL冰醋酸，放置自动电位滴定仪上，插入电极和滴定管，使电极隔膜完全浸没到被滴定的溶液中，打开电极上部的密封塞，启动滴定方法，用高氯酸标准滴定溶液进行滴定，以电位值为纵坐标，滴定时消耗高氯酸标准滴定溶液的体积为横坐标，仪器自动绘制电位值-滴定体积实时变化曲线，曲线明显突跃点为其滴定终点，记录该点所对应的消耗高氯酸标准滴定溶液的体积(V1)。试剂空白实验取2 mL醋酐和60 mL乙酸，记录消耗高氯酸标准滴定溶液的体积(V0)。结果计算见下式：

式中：X为样品中氨基酸态氮的含量(g/100 g)；V1为测定用试样消耗高氯酸标准滴定溶液的体积(mL)；V2为试剂空白试验消耗高氯酸标准滴定溶液的体积(mL)；C为温度校准后高氯酸标准滴定溶液的浓度(mol/L)；0.007为与1.00 mL高氯酸标准滴定溶液[C(HClO4)=1.000 mol/L]相当的氮的质量(g)；m为称取试样的质量(g)；100为单位换算系数。

2 结果与分析

2.1 样品水分去除

水溶液体系通过影响有机碱的碱性从而影响非水滴定的灵敏度，酱油中水分含量在50%左右，因此选择合适的水分去除方法是本次可行性研究的关键之一。本文首先考察了物理烘干和在溶解过程中加入醋酐两种方式，结果表明，酱油样品经过烘干后呈现粘稠胶质状态，在醋酸中溶解困难，滴定曲线杂乱无规律，因此放弃物理烘干。醋酐常用于非水滴定实验以除去样品和醋酸中水分，醋酐的加入量也会对滴定突跃产生一定的影响，因此对醋酐的加入体积进行了考察。酱油配方中水分约为52%～53%[20]，每1 g水能与5.22 mL醋酐定量反应，本方法中酱油取样量为0.5 g，约需要1.305～1.383 mL醋酐，所用醋酸试剂含水量约为0.2%，用量为60 mL，比重为1.05 g/mL，需消耗0.117 mL比重1.08 g/mL含量97.0%的醋酐，综上可知，待滴定试液理论上需要约1.5 mL醋酐去除水分。依据该理论值进行优化实验，各取0.5 g酱油，分别加入醋酐0，1，1.5，2，2.5，3，5，10 mL，均加入60 mL冰醋酸进行测定。结果显示：随着酸酐加入量增大，滴定终点会稍微提前，经过与酸度计法结果比较发现，加入酸酐1 mL时氨基酸态氮含量与酸度计法结果无显著差异。加入1 mL酸酐的典型滴定曲线图见图1。

图1 全自动电位滴定图Fig.1 The diagram of automatic potentiometric titration

2.2 考察方法重复性

按1.2实验方法对样品平行测定6次，考察了方法重复性，并将结果与国标中酸度计法进行对比，结果见表1。电位滴定法和酸度计法相对标准偏差RSD分别为0.16%和0.15%，表明电位滴定法与酸度计法都具有良好的重复性，测定含量与酸度计法进行比较结果无显著差异(P>0.05)。

表1 方法重复性Table 1 The precision of the method

2.3 考察方法回收率

准确称取约0.5 g酱油标准品于100 mL容量瓶中，用乙酸定容，摇匀。对于一固定的酱油样品，分别加入2.5，5.0，7.5 mL酱油标准品，乙酸溶液总体积保持60 mL，按照1.2的方法操作，测定回收率，每个浓度平行3次，结果见表2，回收率在94.87%～97.92%之间。

表2 电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮的回收率(n=3)Table 2 The recovery rates of amino acid nitrogen in soy sauce determined by potentiometric titration method (n=3)

2.4 样品检测

分别用本文所建立的非水滴定法和国标酸度计法对6种不同氨基酸态氮含量水平的酱油进行检测，并将检测结果进行比对，见表3，结果显示无显著差异。

表3 两种方法测定不同样品氨基酸态氮含量Table 3 The amino acid nitrogen content in different samples by two methods

3 讨论与结论

酱油成分复杂，其中氨基酸种类繁多，每种氨基酸是否能充分被滴定以及酱油发酵过程中是否产生其他有机碱参与滴定仍待进一步研究确证。由目前结论可知，本文考察的高氯酸非水滴定法测定酱油中氨基酸态氮含量具有一定可行性，初步建立的高氯酸非水滴定法具有操作简单、重现性好、结果准确度高等优点，为酱油中氨基酸态氮的测定提供了更多可能性，具有广阔的研究及应用前景。