1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖的水相制备研究

邓仕彬，方舒娜，崔和平，张晓鸣*

(1.莆田学院 环境与生物工程学院，枇杷种质资源创新与利用福建省高校重点实验室，福建 莆田 351100；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

美拉德反应是一种自然界中广泛发生的非酶褐变反应，其产物常用来制作食用香精，在食品风味、抑菌、抗氧化性等方面具有广阔的应用前景[1-3]。美拉德反应初级反应阶段的主要产物是Amadori或Heyns重排产物，也称为美拉德反应中间体[4]，其在常温下化学性质稳定，但是在加热条件下很容易裂解产生呋喃类、醛类、吡嗪类化合物等重要风味物质[5]。范丽等[6]利用木糖-L-半胱氨酸的美拉德反应中间体为基液成功制备得到了色、香、味俱佳的红烧调味汁。因此，美拉德反应中间体作为美拉德反应中非常重要的风味前体物，具备制备风味调味料应用于食品中的优势。

目前关于美拉德反应中间体的制备方法已有一些报道，大多都是在无水甲醇等有机溶剂中合成，然而这些制备方法成本较高且污染严重，不适合在食品中应用[7]。工业化常用的美拉德反应中间体制备通常在水相中进行。虽然Cui等[8]、Xu等[9]的研究均实现了美拉德反应中间体的水相制备，但这些方法中的还原糖均以木糖为原料，作为一种反应活性较高的五碳糖，其反应速率明显高于六碳糖。针对六碳糖的美拉德反应中间体的水相高效制备还有待进一步的研究。

本研究以葡萄糖和苯丙氨酸为原料，探索该体系中间体1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖(PDF)的水相制备方法，并对比常压不脱水水相制备、微波加热水相制备和真空脱水水相制备等方法的差异，以期实现PDF的水相制备，确定出最优的制备方法和参数，并进一步开发其在食品调味中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

D-葡萄糖、L-苯丙氨酸、盐酸、氢氧化钠：以上试剂均为分析纯；甲酸、乙腈：以上试剂均为色谱纯；Dowex 50WX4 H+型离子交换树脂、1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖：纯度98%，实验室自制。

1.1.2 仪器

AR124CN型电子天平、ST3100型pH计 奥豪斯仪器有限公司；磁力搅拌器 德国IKA公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海凌科实业发展有限公司；SK5210HP型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；Buchi R-210旋转蒸发仪 上海岛通应用科技有限公司；EM7KCGW3-NR型微波炉 美的公司；Scientz-30ND冷冻干燥机 宁波新芝冻干设备股份有限公司；Milli-Q Integral超纯水仪 美国Millipore公司；高效液相色谱仪 Waters科技(上海)有限公司；液相色谱四极杆串联飞行时间质谱联用仪 美国沃特世公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水相制备PDF

1.2.1.1 PDF的常压不脱水水相制备

以D-葡萄糖和L-苯丙氨酸为原料，配制浓度均为0.2 mol/L的反应溶液。将溶液置于磁力搅拌器上搅拌，通过转子转动使其溶解，再用6 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5。取反应溶液转移至耐高温高压反应瓶中，于90 ℃反应不同时间后，立即取出并冰浴终止反应，反应液保存待测。

1.2.1.2 微波加热水相制备PDF

按上述方法配制反应溶液，将其转移至反应瓶中，在微波功率为500 W条件下反应不同时间后，立即取出并冰浴终止反应，反应液保存待测。

1.2.1.3 真空脱水水相制备PDF

按上述方法配制反应溶液，将其转移至旋转蒸发仪中，水浴90 ℃反应，并在5 min之内脱水完全，反应不同时间后，立即取出并冰浴终止反应。反应固体样品用去离子水溶解并定容至原体积，保存待测。

1.2.2 真空脱水单因素实验对PDF产率的影响

1.2.2.1 不同反应温度的影响

制备方法见1.2.1.3，其中脱水反应温度分别设定为70，80，90，100 ℃。

1.2.2.2 不同反应pH的影响

制备方法见1.2.1.3，用6 mol/L的氢氧化钠溶液或盐酸溶液分别调节pH至6.5，7.5，8.5，9.5。

1.2.2.3 不同反应物配比的影响

制备方法见1.2.1.3，其中苯丙氨酸浓度为0.2 mol/L，苯丙氨酸与葡萄糖的摩尔比分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，真空脱水反应40 min。

1.2.3 PDF的分离纯化

根据1.2.1.3方法制备得到PDF混合溶液，对其进行分离纯化。采用Dowex 50WX4 H+型阳离子交换树脂为分离介质，在其活化完成后进行上样。首先利用去离子水以3 mL/min的速率洗脱以除去未反应的葡萄糖，用高效液相色谱-串联蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)检测洗脱液直至葡萄糖冲洗干净为止，然后用0.18 mol/L的氨水溶液以1 mL/min的速率洗脱并收集洗脱液，用HPLC-ELSD检测并合并含有PDF的组分，经冷冻干燥后得到淡黄色粉末，置于干燥器中备用。

1.2.4 超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用(UPLC-TOF-MS)分析PDF

取PDF固体粉末配制成溶液，使用UPLC-TOF-MS对其进行结构表征[10]。

液相色谱条件：色谱仪Waters Acquity UPLC；检测器Waters Acquity PDA；分析柱Acquity UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；流动相：A为1%甲酸，B为乙腈；梯度洗脱程序：98%～0% A，梯度洗脱20 min；流速0.3 mL/min；柱温45 ℃；检测波长200～600 nm；进样体积1 μL。

质谱条件：正离子模式电喷雾离子源(ESI+)；离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度400 ℃，气流量700 L/h；毛细管电压3.5 kV；锥孔电压20 V；探测器电压1800 V；锥孔气流量50 L/h；碰撞能量6 V；质量范围20～1000 m/z。

1.2.5 PDF的HPLC-ELSD定量分析

利用HPLC-ELSD分析PDF，色谱条件：Waters Select C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为1%甲酸，B为乙腈；梯度洗脱程序：98%～90% A，梯度洗脱15 min，流速1 mL/min；进样体积10 μL；柱温45 ℃；检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；ELSD参数：漂移管温度为55 ℃；载气为氮气；气体流量为1.5 L/min；增益为1。

以制备的PDF粉末样品为标准品，配制一系列浓度标准溶液，通过HPLC-ELSD分析，基于浓度与峰面积的关系制作标准曲线为y=4.1548×106x-8.4981×105，R2=0.9922。其中x表示PDF的浓度，y表示峰面积。根据标准曲线对PDF进行定量分析。PDF的摩尔浓度与苯丙氨酸的初始摩尔浓度的比值即为PDF的产率。

1.2.6 数据分析

上述的每次实验均设3个重复。测定所得数据制作成折线图并进行误差分析，分析不同制备条件的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 PDF的UPLC-TOF-MS结构表征

基于PDF定量分析和产率计算的需要，首先对分离纯化后的PDF固体粉末进行UPLC-TOF-MS结构表征，得到PDF的总离子流图和质谱图，分别见图1和图2。

图1 PDF的总离子流色谱图Fig.1 The total ion flow chromatogram of PDF

图2 PDF的质谱图Fig.2 The mass spectrogram of PDF

由图1可知，保留时间为3.77 min的峰即为纯化后的PDF对应的色谱峰。通过计算PDF与其他杂质峰的峰面积可知PDF的纯度为98%。由图2中PDF的色谱图可知，苯丙氨酸-葡萄糖体系制备得到的美拉德反应中间体1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖的质子化分子[M+H]+峰为328，因此推断其相对分子质量为327，这与理论推算一致，说明其为目标产物PDF。此外，质子化分子[M+H]+脱去一分子水和两分子水分别形成m/z=310和m/z=292的离子碎片。m/z=264、m/z=166和m/z=166分别为[M+H-H2O-COOH]+、[AA+H]+和[AA+H-COOH]+的碎片离子，这些均与Davidek等[11]的报道一致。因此，证实了PDF的相对分子质量为327，分子式为C15H21NO7。

2.2 不同制备方法对PDF产率的影响

目前美拉德反应中间体的制备方法以有机相合成法为主，主要以无水甲醇为溶剂，将反应底物溶解后加热回流制备。该反应较为激烈，反应副产物较多，且有机溶剂的使用使得制备成本升高，还可能造成污染，因此该方法不适合应用于食品中。水相制备法则能够一定程度上解决有机相合成法成本高和污染严重的问题，但也存在制备产率较低的缺陷。因此，实现美拉德反应中间体的水相制备并将其开发为调味产品应用于食品，对于调味品的丰富与开发具有重要价值。本研究探索了常压不脱水反应、微波加热反应、真空脱水反应3种水相制备方法对苯丙氨酸-葡萄糖体系美拉德反应中间体PDF产率的影响。由图3中(a)可知，随着90 ℃常压不脱水反应时间的增加，PDF产率逐渐提升并在160 min后达到产率最大值1.28%。PDF在生成的同时，也会发生可逆反应,生成原料苯丙氨酸和葡萄糖以及参与后续的美拉德反应而被消耗，导致常压不脱水反应制备PDF的产率较低，无法真正实现PDF在食品加工中的应用。随着反应时间的增加，PDF产率逐渐降低，表明此时PDF降解速率高于生成速率，无法实现PDF的有效累积，因此不适于PDF的工业化大量制备。

图3 不同制备方法对PDF产率的影响Fig.3 The effects of different preparation methods on the yield of PDF

微波加热作为近几年来在食品工业中广泛应用的新型加热方法，具有高效、环保、节能的特点。由图3中(a)可知，微波加热下PDF的产率要高于常压不脱水反应，且达到最大产率的时间短于常压不脱水反应法，这说明微波加热促进了美拉德反应进程的进行，对于PDF产率的提升有促进作用。这主要是因为微波加热具有较强的物料穿透能力，能够显著增加原料分子的接触与摩擦，从而促进分子之间的相互作用[12]。段邓乐[13]的研究表明，相比于水浴加热，微波加热中游离氨基酸含量减少的更多，早期反应程度也更高。顾宗珠等[14]的研究也表明，微波加热相比于普通加热方式，可缩短加热时间，提高反应效率和减少副反应的发生。然而，微波加热下PDF的最大产率也仅为1.91%，还远远无法达到有效提升PDF产率的目的。

PDF在水相中无法大量积累的事实说明PDF的生成速率较慢或降解速率较快。而一系列研究表明美拉德反应中间体具有良好的化学稳定性，说明其在较低温度下降解速率较慢[15-16]。因此，水相制备PDF产率较低的原因推测为原料苯丙氨酸和葡萄糖转化为PDF的反应过程受到限制。基于美拉德反应历程分析，苯丙氨酸和葡萄糖缩合形成PDF的过程中脱去一分子水，通过促进脱水反应的进行，则可能实现PDF产率的有效提升。由图3中(b)可知，真空脱水反应法能够显著提升PDF的产率，并在脱水反应30 min后达到最大产率20.01%，说明除去反应体系中的水分对于促进苯丙氨酸和葡萄糖向PDF的转化具有显著的作用。此外，真空脱水显著降低了制备PDF的时间，对于减少经济成本具有一定优势。

2.3 真空脱水温度对PDF产率的影响

由图4可知，不同温度下脱水反应初期的产率提升均较慢，这主要是因为该过程还处在浓缩阶段，体系中还存在较多的水分，不利于脱水反应的进行。脱水温度为70 ℃时，PDF的产率随着反应时间的延长而逐渐提高，但生成速率较慢，说明低温不利于PDF的生成。当脱水温度为80，90，100 ℃时，PDF的产率逐渐提升，而后随着时间的延长其产率逐渐降低。这说明脱水反应初期PDF的生成速率较快，而反应后期PDF的消耗加快，使产率逐渐下降。另外，反应温度越高，PDF产率所能达到的最高值越大，届时所需要的时间越小，说明温度的提升有利于苯丙氨酸和葡萄糖向PDF的转化。

图4 脱水温度对PDF产率的影响Fig.4 The effects of dehydration temperatures on the yield of PDF

在美拉德反应初级阶段，还原糖的羰基与氨基酸的氨基发生缩合反应并脱去一分子水产生希夫碱，再环化形成N-取代醛基胺，该物质进一步发生重排后形成美拉德反应中间体[17]。反应体系中水的存在直接影响着氨基酸和还原糖向美拉德反应中间体的高效转化，也是导致水相制备美拉德反应中间体产率较低的制约因素。而温度的提升除了提高脱水的速率外，还能够有效促进N-取代醛基胺向ARP的转化。因此，脱水反应对于提升六碳糖的美拉德反应中间体的产率也是有效的。另外，图4也表明100 ℃脱水反应下PDF产率的提升与降低均较快，难以保证制备产率的稳定性，且100 ℃真空脱水反应条件也不利于控制。因此，从PDF的产率及实际操作的控制来看，最佳的真空脱水反应温度为90 ℃。

2.4 反应初始pH对PDF产率的影响

在美拉德反应过程中，pH值越高，反应速率越快，而美拉德反应历程较为复杂，pH对不同阶段的反应速率影响有所差异[18]。

由图5可知，反应体系中pH值对PDF的产率也有显著影响。当初始pH为6.5时，PDF的产率逐渐提升，在反应60 min后达到最大值为15.1%，随着时间延长,产率逐渐降低。当pH为7.5时，PDF的产率增加较快且在30 min时达到20.1%，这说明pH值从酸性到弱碱性的变化过程中有利于PDF产率的提升。酸性条件下，苯丙氨酸上的氨基被质子化，导致其亲核能力下降，不利于PDF的形成[19]。当反应体系初始pH为8.5时，PDF的产率升高较快，且在20 min后达到产率最高值21.1%，说明随着溶液由弱碱性逐渐增强的过程中有利于PDF产率的提升。然而，当pH值达到9.5时，PDF虽然前期升高较快，但其产率最高值仅为16.7%，这可能是因为强碱性条件下PDF的消耗较快。Jalbout等[20]的研究表明，碱性条件下有利于提高美拉德反应第二阶段和第三阶段的反应速率，从而促进PDF的消耗和次级反应产物的形成。因此，酸性和强碱性均不利于PDF的水相制备，最佳的制备初始pH值选择8.5。

图5 反应pH对PDF产率的影响Fig.5 The effects of pH values on the yield of PDF

2.5 苯丙氨酸和葡萄糖摩尔比对PDF产率的影响

选择最适的制备温度90 ℃和pH 8.5为反应条件研究苯丙氨酸和葡萄糖的摩尔比对PDF产率的影响。

由图6可知，当苯丙氨酸和葡萄糖的摩尔比为1∶3时，PDF的产率最大。随着底物葡萄糖含量的增加，有效促进了苯丙氨酸的转化，从而促进了PDF产率的提升。而当苯丙氨酸摩尔浓度高于葡萄糖时，PDF的产率较低。这主要是因为PDF的产率以苯丙氨酸的浓度来计算，在苯丙氨酸摩尔浓度保持一致的情况下，苯丙氨酸和葡萄糖的摩尔比越高，葡萄糖含量越低，因此不利于PDF的生成。此外，当苯丙氨酸和葡萄糖摩尔比为1∶2和1∶3时，PDF产率虽然相比于摩尔比1∶1有所提升，但提升并不明显。因此，从节约经济成本考虑，选择苯丙氨酸和葡萄糖摩尔比为1∶1最佳。

图6 反应物摩尔比对PDF产率的影响Fig.6 The effect of molar ratios of reactants on the yield of PDF

3 结论

研究表明，PDF的不同水相制备方法对其产率有重要影响，其中常压不脱水水相制备法和微波加热水相制备法的产率较低，而真空脱水水相制备法通过促进PDF形成途径中脱水反应的进行从而有效提升PDF的产率。当真空脱水反应温度为90 ℃，初始反应pH为8.5，苯丙氨酸和葡萄糖摩尔比为1∶1时，PDF的产率最大，并达到21.1%，相比于常压水相法PDF产率显著提升。为对该法制备的PDF样品进行结构表征，采用了阳离子交换树脂对其进行分离纯化，通过UPLC-TOF-MS鉴定了其纯度达到98%，并明确了相对分子质量为327，分子式为C15H21NO7。