高效液相色谱法测定庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中维生素B12的含量及含量均匀度的评价

梁秋霞,陈 瀚,黄丽丽,朱健萍,卢日刚

(广西壮族自治区食品药品检验所,南宁 530021)

庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊是由硫酸庆大霉素、盐酸普鲁卡因、维生素B12等3种原料及适量辅料[内含淀粉、玉米淀粉、黏合剂、羧甲基纤维素、硬脂酸镁、70%(体积分数)乙醇溶液等]组成的复方口服制剂。每粒庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊含有20 000单位庆大霉素、0.1 g盐酸普鲁卡因、0.01 mg维生素B12,在临床上主要用于缓解急、慢性胃炎等,具有消炎、止痛、促进胃黏膜修复等功效。现行标准为《国家药品标准》化学药品地方标准上升国家标准 第六册WS-10001-(HD-0524)－2002《庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊》、国家食品药品监督管理局标准YBH 20972006(浙江天瑞)《庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊》和国家食品药品监督管理局标准YBH 15222004(海口奇力)《庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊》。维生素B12在该制剂中含量很低,但它作为制剂中的主要成分,其含量是关键控制指标,但现行的标准中未设与维生素B12相关的鉴别、检查及含量测定等项目。为确保用药安全,需建立准确、灵敏的分析方法来测定该制剂中维生素B12的含量,避免因服用过量或不足带来的危害[1-3]。

药物制剂中维生素B12含量的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[4-7]、原子吸收光谱法[8]、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[9]、紫外吸光光度法[10]、可见吸收光谱法[11-12]、微生物法[13]等。虽然庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中的维生素B12和盐酸普鲁卡因均是具有共轭结构的水溶性物质,可采用HPLC中的紫外检测器测定它们的含量,但普鲁卡因不影响维生素B12的出峰;庆大霉素在检测器上无响应,也不会干扰维生素B12的测定。文献[14]采用液相色谱法快速分离和测定了庆大霉素普鲁卡因维B12颗粒中维生素B12的含量,但该方法采用的测定仪器为装有1.8μm 小粒径色谱柱和扩展进样环的超高效液相色谱仪,对于一般的分析实验室,尤其是中小型药物生产企业实验室,这种条件要求较高,不能普遍应用。由于目前尚未见庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中维生素B12含量测定的报道,本工作采用HPLC测定了47批庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中维生素B12的含量,并评价了不同厂家生产的相同批次或不同批次样品中维生素B12的含量均匀度,以期为完善和提高庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊质量标准提供依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD);KQ-500DB型超声波清洗器;XS 205DU型电子分析天平;Milli-Q Reference型超纯水机。

维生素B12对照品储备溶液:100 mg·L－1,称取维生素B12对照品(批号100248－2002)约10 mg,用水溶解并定容至100.0 mL,摇匀。

维生素B12标准溶液系列:取适量维生素B12对照品储备溶液,用水作为溶剂逐级稀释,配制成0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5,3.0,5.0 mg·L－1的维生素B12标准溶液系列。

维生素B12对照品溶液:1.0 mg·L－1,称取维生素B12对照品约10 mg,用水溶解并定容至100.0 mL,摇匀,用0.45μm 滤膜过滤,取1 mL 滤液置于100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀。

甲醇为色谱纯;磷酸氢二钠等其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

用于测定含量的庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊样品共47批,分别为A 厂3批、B厂3批、C厂3批、D厂38批;用于评价含量均匀度的样品共6批,分别为A厂1批、B厂1批、C厂1批、D厂3批。

1.2 仪器工作条件

CAPCELL PAK ACR C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30 ℃;流量1 mL·min－1;进样量100μL;检测波长362 nm。流动相:A 为甲醇,B为0.028 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液(pH 3.2)。梯度洗脱程序:0～3 min时,A 为15%;3～15 min时,A 由15%升至28%,保持2 min;17～19 min时,A 由28%降至15%,保持6 min。

1.3 试验方法

1.3.1 样品中维生素B12含量的测定

取出同厂同批次的20颗庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊内容物并将其混合均匀。称取适量内容物(其中维生素B12质量约为10μg),加水约5 mL,超声5 min(控温25 ℃),用水定容至10.0 mL,摇匀,用0.45μm 滤膜过滤,滤液即为含量测定用供试品溶液A。每批样品制备两份供试品溶液A,按照仪器工作条件测定其中维生素B12的含量。

1.3.2 含量均匀度评价

取庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊1 粒,加水约5 mL,超声5 min(控温25 ℃),用水定容至10.0 mL,摇匀,用0.45μm 滤膜过滤,滤液即为含量均匀度测定用供试品溶液B。每批样品制备10份供试品溶液B,按照仪器工作条件测定其中维生素B12的含量,用于含量均匀度评价。

1.3.3 阴性样品溶液的制备

按各企业处方称取辅料,按供试品溶液A 的制备方法制备阴性样品溶液,按照仪器工作条件测定其中维生素B12的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对维生素B12对照品溶液、供试品溶液A、阴性样品溶液进行测定,所得色谱图见图1。

图1 对照品溶液、供试品溶液A 和阴性样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of reference solution,test solution A and negative sample solution

由图1可知:供试品溶液A 中维生素B12的保留时间为14.98 min,与相应对照品溶液的一致,而阴性样品溶液在相同保留时间处无色谱峰,表明辅料对维生素B12的测定无干扰。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 流动相

试验考察了分别以甲醇-水体系、甲醇-磷酸二氢钾溶液体系、甲醇-0.028 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液体系作为流动相时对维生素B12测定的影响。结果表明:以甲醇-0.028 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液(pH 3.2)体系进行梯度洗脱时,庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中维生素B12可以和盐酸普鲁卡因有效分离,且维生素B12的保留时间适宜、峰形较好,能够满足分析要求。因此,试验选择的流动相为甲醇-0.028 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液(pH 3.2)体系。

2.2.2 检测波长

利用DAD 的在线扫描功能,在波长200～800 nm 内对对照品溶液进行紫外吸收光谱扫描,结果见图2。

图2 维生素B12的紫外扫描光谱图Fig.2 UV scanning spectrum of Vitamin B12

由图2可知:维生素B12有两个吸收峰,分别在362,550 nm 处。在实际测试时发现,550 nm 处的基线较362 nm 的平稳,但此处的吸光度仅为362 nm 处的30%。由于样品中维生素B12的含量较低,综合考虑灵敏度和稳定性等因素,试验选择的检测波长为362 nm。

2.3 标准曲线和测定下限

按照仪器工作条件对维生素B12标准溶液系列进行测定,以维生素B12的质量浓度为横坐标,其对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,标准曲线的线性范围为0.2～5.0 mg·L－1,线性回归方程为y＝98.32x－2.320,相关系数为1.000。

以10倍信噪比(S/N)计算测定下限(10S/N),所得结果为0.12 mg·L－1。

2.4 仪器精密度试验

按照仪器工作条件对维生素B12对照品溶液分别测定6次,得到维生素B12峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.2%。

2.5 稳定性试验

将供试品溶液A 分别放置0,2,4,8,12,16 h后,在仪器工作条件下测定,得到维生素B12的峰面积的RSD 为0.60%。

2.6 重复性试验

取A 厂的庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊(批号为17011501),按试验方法制备6份供试品溶液A,分别在仪器工作条件下测定,得到维生素B12的测定值为标示量的94.4%,测定值的RSD 为1.5%。

2.7 回收试验

取A 厂批号为17011501 的样品9 份,每份约0.1 g,溶解后分别置于10 mL容量瓶中,分为3组,每组3份,每组分别对应加入5.0 mg·L－1维生素B12对照品溶液3.0,5.0,7.0 mL,按试验方法制备供试品溶液A 并测定,计算维生素B12的回收率,结果见表1。

表1 回收试验结果Tab.1 Results of tests for recovery

由表1可知,维生素B12的回收率为96.9%～102%。

2.8 原辅料相容性试验

参考文献[15],试验考察了由4个生产企业提供的辅料对测定的影响。将维生素B12和辅料按质量比1∶5的比例进行混合,然后按1.3.1节方法进行原辅料相容性试验,同时与相同质量浓度的维生B12对照品溶液的测定结果进行比对。若两者的峰面积差别明显,则应对产生这种差异的原因进行进一步的探究。结果显示,两者维生素B12的峰面积基本无差别,说明所用辅料对维生素B12的含量测定无明显影响。

2.9 样品分析结果的差异及原因分析

按1.3.1节方法测定47批样品中的维生素B12含量,并参考中国药典二部中对于制剂有效成分含量的计算方法,计算测定值的相对质量百分数(相对于标示量),所得结果和结果分布图见表2和图3。/

表2 47批样品分析结果Tab.2 Analytical results of 47 batches of samples

图3 4个厂家的47批样品中维生素B12的测定结果分布图Fig.3 Results distribution of Vitamin B12in the 47 batches of samples from 4 manufacturers

中国药典二部中对于主成分含量限度的要求一般为标示量90.0%～110.0%,因庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中维生素B12的标示量较低(每粒仅含10μg),故可将此限度放宽至80.0%～120.0%。由表2结果可知:在所分析的47 批样品中,来自A厂、B厂、C厂的9批样品中的维生素B12的相对质量百分数为95.0%～110.0%,均在要求的范围内;D 厂的为55.4%～137.0%,超出要求的范围,异常样品有9批,其中,有1批样品的测定值小于标示量的80.0%,有8 批样品的测定值大于标示量的120.0%,推测可能和样品的均匀度有关。

为了考察相同批次或不同批次样品的均匀度,按1.3.2节试验方法将A 厂、B 厂、C 厂各一个批次和D 厂3个批次共计6批样品制成供试品溶液B,并对其中维生素B12含量进行测定。每批制备10个供试品溶液,计算测定值的相对质量百分数(相对于标示量),并计算了测定值的标准偏差(s)、标示量与测定值之差的绝对值(A)以及判别结果(L,L＝A＋2.2s),结果见表3。

表3 6批样品含量均匀度试验结果Tab.3 Results of test for content uniformity of 6 batches of samples

根据中国药典二部中对于主成分含量的要求及胶囊样品中维生素B12的标示量较低的特点,将含量均匀度判别结果L值的限值定为±25.0%。表3结果显示,A 厂、B厂、C 厂的3批样品的L值均小于20.0%,D 厂的3批样品的L值均大于25.0%。试验还发现:D 厂的供试品溶液B 的颜色有深有浅,而D 厂所用辅料均为非红色,而维生素B12原料为深红色结晶或结晶性粉末,说明溶液颜色差异可能与维生素B12含量差异有关;D 厂同一批10个供试品溶液B 中维生素B12相对质量百分数波动较大,在70.0%～300.0%内浮动。由此可知,是D 厂样品批次内与批次间样品中的维生素B12含量的不均匀导致了D 厂的部分样品含量的差异。

试验分析了D 厂维生素B12含量不均匀的原因。从原辅料相容性试验结果可知,原辅料对维生素B12的含量无明显影响。从A 厂、B 厂、C 厂以及D 厂反馈的调查问卷情况及实地调研可知:D 厂采用干法混合三种主成分和辅料,而A 厂、B 厂和C厂均先采用水或70%(体积分数)乙醇溶液将维生素B12溶解后,再采用喷洒的方式与其他材料混匀。由此推测,D 厂批内和批间样品中维生素B12含量的不均匀可能与干法混合工艺有关。因此,建议D 厂开展核查工作,确定干法混合工艺是否与维生素B12含量不均匀相关,以便提高产品质量。

本工作建立了测定庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊中维生素B12含量的高效液相色谱法,并对不同厂家同一批次或不同批次样品中的维生素B12含量均匀度进行了评价,并查找了产生含量不均匀的原因。该方法具有操作简单、准确度高、稳定性和重复性好,所需的分析时间与超高效液相色谱法的接近等优点,可为庆大霉素普鲁卡因维B12胶囊质量标准的提高提供依据。