中试膜生物反应器中猪场沼液部分亚硝化快速启动试验

卞含笑，隋倩雯，郑 蕊，董红敏，郝志鹏，薛鹏英，宋 曼，朱志平※

（1. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，农业农村部设施农业节能与废弃物处理重点实验室，北京100081；2. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室，北京 100085；3. 安平县弘嘉环保技术有限公司，衡水 053600）

0 引 言

猪场废水成分复杂，含有大量有机物、氮和磷等物质[1]，目前猪场废水大多数采用厌氧处理降解有机物，但会产生大量氨氮浓度高、碳氮比低的厌氧消化液，部分处理工程不能完全实现还田利用，如果未经处理随意排放到水生态系统中，将不可避免地产生严重的水体污染，破坏生态环境[2]。因此，有必要对猪场厌氧消化液进行脱氮处理，达到污染物排放标准后排放或消毒处理后安全回用。近几年，厌氧氨氧化（Anaerobic ammonium oxidation，Anammox）作为一种新型生物脱氮工艺受到关注[3]，与传统硝化/反硝化脱氮工艺相比，厌氧氨氧化工艺具有不需要有机碳源、节省曝气能耗、降低污泥产量等重要优势[4-5]，特别适于高氨氮、低碳氮比的猪场厌氧消化液处理。其反应原理是，厌氧氨氧化菌在缺氧条件下使用亚硝酸盐氮作为电子受体将氨氮氧化为氮气。

部分亚硝化-厌氧氨氧化反应首先将部分氨氮转化为亚硝酸盐氮，之后利用厌氧氨氧化反应进一步脱氮。因此，启动亚硝化反应，有效抑制亚硝酸盐氧化细菌（Nitrite Oxidizing Bacteria，NOB）是启动部分亚硝化-厌氧氨氧化反应的重要环节。关于实验室规模部分亚硝化工艺的理论研究已较为成熟[3,6-7]，已从影响部分亚硝化运行参数如溶解氧（Dissolved Oxygen，DO）、温度、pH值、游离氨（Free Ammonia，FA）、游离亚硝酸（Free Nitrous Acid，FNA）和碱度等因素进行了试验研究[8-10]。

反应器类型对亚硝化、厌氧氨氧化启动与运行具有一定的影响。以往研究中采用序批式反应器（Sequencing Batch Reactor，SBR）[11-13]，但存在污泥沉降性能差，易流失的问题。膜生物反应器（Membrane Bioreactor，MBR）可有效截留污泥，有利于目标功能菌氨氧化细菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）的快速富集，同时MBR连续流的运行模式具有高效膜分离效率、占地面积小、容积负荷高等优势，更有利于大规模污水处理工艺。张婷等[14]在实验室规模上对比了CSTR和MBR短程硝化的启动性能，MBR实现了污泥的完全截留，避免了AOB流失，有助于短程硝化的快速启动；Wang等[15]比较了MBR和SBR 2种常规活性污泥的厌氧氨氧化启动性能，MBR经过59 d成功启动厌氧氨氧化，而SBR经过101 d才启动厌氧氨氧化，MBR的启动时间明显短于SBR，同时进一步揭示了MBR具有较好的厌氧氨氧化菌的生物多样性和较高的生态稳定性，MBR在亚硝化、Anammox启动中表现出了较好的性能。上述研究均在实验室条件下开展，在猪场厌氧消化液处理工程中，可用于启动中试规模MBR反应器中部分亚硝化的控制参数报道较少。且实际废水来源波动大，处理量大，该工艺仍存在启动时间长、操作复杂、稳定性差等问题，需要开展试验研究。

针对目前研究的不足，本研究在中试规模（有效容积为12 m3）采用连续流MBR开展部分亚硝化反应的快速启动研究，以河北省衡水市某猪场厌氧消化液为处理对象，通过控制DO值、pH值和间歇曝停时间，实现部分亚硝化的快速启动，考察MBR反应器内部分亚硝化的性能、菌群结构演替及功能微生物的变化，为部分亚硝化耦合厌氧氨氧化工艺在大规模猪场厌氧消化液处理中工程应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验装置

中试试验反应器装置如图1所示。长方体反应器（长4 m，宽2 m，高2 m）由不锈钢板制成，亚硝化池和MBR池总容积为16 m³，有效容积为12 m3。反应器由底座、箱体、曝气系统、MBR膜系统、控制系统组成，本装置的箱体和曝气、回流与膜抽吸与清洗系统固定安装在底座上，形成一体化处理设备。反应器的所有装置均通过PLC控制系统进行自动控制，通过控制柜控制进水泵连续进水至进水调节池，进水调节池、亚硝化池及MBR池之间通过溢流口实现连续流。亚硝化池底部安装曝气管，控制风机间歇运行时间和强度，实现反应器内亚硝化池内低DO运行，达到抑制NOB活性和提高AOB的活性的目的。MBR池内安装有膜组件，通过膜组件和抽吸泵的抽吸完成排水，主要作用是实现系统污泥的高效截留，有利于富集生长缓慢的AOB，减少部分亚硝化的启动时间。

1.2 试验用水及接种污泥

试验用水采用河北省衡水市某猪场厌氧消化液，启动试验期间由于养殖量原因，猪场沼液浓度偏低，通过外加碳酸氢氨（NH4HCO3）的方式调节进水氨氮浓度。反应器接种现有厌氧消化液处理池内（1 200 m3/d）的活性污泥，接种后反应器内污泥浓度为4.0 g/L。

1.3 运行方式

在亚硝化池和MBR池内同步启动部分亚硝化试验，控制风机间歇运行时间，实现反应器内亚硝化池及MBR池的间歇曝气，反应器内固定pH值探头和DO探头，控制亚硝化池和MBR池内pH值为8.0±2.0，DO值为0.2～0.5 mg/L。水力停留时间（Hydraulic Retention Time，HRT）设置为48 h，从MBR池至亚硝化池的回流比（R）设置为200%，污泥龄（Solid Retention Time，SRT）为30 d，通过定期排泥控制污泥浓度。MBR池内抽吸泵的抽停时间设置为8 min 开、2 min关，每10 min一个抽吸循环，完成25次循环后，膜组件进行自动在线反冲洗，冲洗时间设置为10 min。整个部分亚硝化运行过程为73 d，期间在运行至第39天时，MBR池的膜组件跨膜压差达到38 kPa，对膜组件进行一次在线药洗（次氯酸钠，0.5%；柠檬酸，1%）。运行参数如表1所示。

表1 部分亚硝化不同阶段运行参数Table 1 Operational parameters at different stages

1.4 采样及分析方法

1.4.1 水质指标

试验过程中每天上午9：00时采集进水调节池内进水和MBR池出水各100 mL，用于水质指标的检测，试验中各项常规水质指标测定按标准方法进行[16]，NH4+-H的测定采用纳氏试剂分光光度法，NO2--N的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO3--N的测定采用紫外分光光度法，混合液悬浮固体浓度（Mixed Liquid Suspended Solids，MLSS）：标准质量法。亚硝酸盐氮的积累率和氨氮氧化速率计算公式如下：---

式中NAR表示亚硝酸盐氮的积累率，%；NO2--Neff和NO3--Neff分别表示出水亚硝酸盐氮和硝酸盐氮质量浓度，mg/L；AAR表示氨氮氧化率，%；NH4+-Ninf和NH4+-Neff分别表示进水和出水的氨氮质量浓度，mg/L。

1.4.2 AOB、NOB活性的测定[17]

取1 000 mL混合液，初始NH4+-N浓度、NO2--N浓度为中试反应器内实际浓度，初始pH值为8.0左右，温度控制在37℃，曝气并保持DO＞4.0 mg/L，每隔20 min取样一次，测量NH4+-N、NO3--N、NO2--N。根据NH4+-N浓度降低与NO3--N浓度升高斜率换算AOB与NOB活性，活性单位为g/（g·d），以MLSS计。

1.4.3 微生物群落结构分析

分别对MBR池和亚硝化池中启动阶段及稳定运行阶段的污泥样品进行采样保存，用于DNA提取、PCR扩增及高通量测序以获16S rRNA基因序列。采样时间为第1、8、16、22、28、34、第40天，样品编号分别为D1、D1-M、D8、D8-M、D16、D16-M、D22、D22-M、D28、D28-M、D34、D34-M、D40、D40-M；其中样品编号中后缀M代表MBR池样品，无后缀代表亚硝化池样品。将 14个污泥样品摇匀后分别放入50 mL离心管，保存于-70 ℃冰箱，然后送至某生物科技公司进行DNA提取、PCR 扩增纯化，然后采用 Illumina MiSeq 高通量测序技术进行微生物菌群多样性分析。

对得出的数据进行Alpha多样性分析，计算α多样性指数，其中：Coverage 指数反映测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况；Chao指数描述微生物群落丰度，数值越大，丰度越高；Shannon指数描述微生物多样性，数值越大，说明群落多样性越高；Simpson指数估算样本中微生物多样性，指数值越大，说明群落多样性越低。采用Hemi软件（http://hemi.biocuckoo.org/）对每个样本中前10个属进行了热图绘制。主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）和冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）采用Canoco 5.0（Microcomputer Power,USA）绘制。

2 结果与讨论

2.1 部分亚硝化过程中氮素的转化

实现NAR≥50 %，且NO2--Neff和NH4+-Neff的比值接近1∶1是启动部分亚硝化的调控目标[18]。试验的启动阶段在常温状态下（22～28.4 ℃）进行，主要分为接种调试期和亚硝酸盐氮积累期，部分亚硝化启动及稳定运行过程中氮素的转化如图2所示，图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别代表接种调试阶段、亚硝酸盐氮积累阶段和稳定运行阶段。

接种调试阶段（第1～11天），DO值保持在0.2～0.5 mg/L，NO2--Neff浓度较低，NO2--N虽有少量的积累，但明显低于NO3--N的产生量。NO3--Neff的浓度呈逐渐上升的趋势，从最初浓度19.3 mg/L上升至最高浓度为198.5 mg/L。在第5～9天，NO2--N有了少量的积累，但反应的第10天，由于NH4+-N浓度仅有少量剩余，导致反应器内的溶解氧过量，部分NO2--N被氧化为NO3--N，NO2--Neff降低至7.51 mg/L。该阶段氨氧化率逐渐提高，最终接近100%，NO2--Neff与NH4+-Neff的比值虽上升至2.86，但NH4+-Neff基本全部转化为NO3--N，少量生成NO2--N，表明该阶段主要以硝化反应为主，反应器内对NOB无明显抑制现象，AOB活性呈增长的趋势。

亚硝酸盐氮积累阶段（第12～23天），提高了NH4+-Ninf浓度，同时保持DO值在0.2～0.5 mg/L，NO2--Neff出现明显的积累现象，NO2--N的积累量从3.65%上升至76.53%，NO2--N的浓度最高达到208.65 mg/L。同时，NO3--N的浓度虽稍微有增长但总体呈下降趋势，NO3--Neff浓度由226.46 mg/L下降至65.98 mg/L。表明该阶段，AOB的活性持续升高，在系统中占据明显优势地位，反应器内的主导反应逐渐由硝化反应转变为部分亚硝化反应，NH4+-Neff浓度保持在200 mg/L左右，AAR基本稳定在50%，NO2--Neff和NH4+-Neff的比值约为1∶1，表明该阶段部分亚硝化启动成功。顾平等[19]在实验室水平下，经过 25 d 成功启动了猪场厌氧消化液亚硝化工艺；吴鹏等[20]对连续流反应器短程硝化的快速启动了进行研究，利用间歇曝气，依次控制停/曝时间经过60 d左右的运行，才实现了较高NO2--N的积累。本研究在中试水平上在23 d内实现了NO2--N的浓度积累达到208.65 mg/L，NAR达到76.53%，一定程度上体现了MBR反应器启动部分亚硝化反应的优势。

稳定运行阶段（第24～73天），常温状态下（28.9～33 ℃），该阶段NO3--Neff浓度逐渐降低稳定在30 mg/L左右，表明反应器内亚硝酸盐氧化反应微弱，NOB活性已受到稳定抑制。NAR一直稳定在较高水平，最高达到87.95%，实现了稳定的NO2--N积累，NO2--Neff和NH4+-Neff的浓度分别为（197.68±27.51）、（215.61±33.91）mg/L，部分亚硝化已经稳定运行。厌氧氨氧化反应需要部分亚硝化过程提供严格的进水ρ(NO2--N)/ρ(NH4+-N)（理论上在1.32左右），在厌氧条件下，Anammox 菌同时利用NH4+-N和NO2--N产生N2而脱氮[21]。此阶段通过调整反应器间歇曝气曝停比为20 min∶20 min，控制氨氧化程度，将进水约50%的NH4+-N被AOB氧化为NO2--N，抑制NOB将NO2--N氧化为NO3--N，保持NO2--N的积累率及使出水的ρ(NO2--N)/ρ(NH4+-N)稳定在1.1∶1，出水条件达到进行厌氧氨氧化的基本需求。许恩惠[22]采用两段式反应器，启动了部分亚硝化达到出水NH4+-N和NO2--N比例为1∶1.2，以亚硝化段的出水作为厌氧氨氧化段的进水，中试水平上实现了2段式厌氧氨氧化工艺的成功启动。王钦砼[23]在成功启动亚硝化工艺的基础上接种少量厌氧氨氧化污泥，实现了亚硝化-厌氧氨氧化一体化工艺的成功启动并稳定运行。由此可见，部分亚硝化的实现对亚硝化-厌氧氨氧化工艺有着重要意义，本试验的出水条件也符合厌氧氨氧化工艺的启动要求。

2.2 部分亚硝化过程中AOB、NOB活性的变化

AOB和NOB活性决定部分亚硝化过程中氨氮的氧化产物[24]，部分亚硝化过程的启动和稳定的运行，一般是有效抑制NOB活性或大幅提高AOB活性，两者兼顾则能够实现更大幅度的NH4+-N氧化与NO2--N累积[25]。

部分亚硝化启动及稳定运行过程中AOB、NOB活性的变化如图3所示，反应启动初期，接种的AOB与NOB的活性均处于较低水平，AOB的活性为0.086 g/(g·d)，NOB活性为0.017 2 g/(g·d)，AOB活性稍高于NOB活性，验证了在反应初期NO2--N仍有少量的积累。随着反应的进行，逐步提高了反应器内NH4+-H的进水浓度，AOB的活性呈现明显地大幅度上升，反应进行的第22天，AOB活性明显的提高至0.43 g/(g·d)，且一直维持在（0.4±0.02）g/(g·d)，这也解释了反应器内NO2--N可以快速实现积累。NOB活性小幅度上升后降低并维持在0.1 g/(g·d)左右，AOB的活性与NOB的活性在反应过程中均呈上升趋势，但是AOB的增幅要远高于NOB，因此，仍能够维持一个较高的NO2--N累积率。

2.3 微生物群落演替及功能微生物丰度变化

反应器内污泥样品微生物群落Alpha多样性分析结果见表3。由表3可知，所有样品Coverage指数均达到0.98以上，说明测序结果能够较真实地反映样品中微生物群落。Shannon指数和Chao指数整体呈上升趋势，Simpson指数呈下降趋势，由此可知在试验过程中，反应器内的微生物多样性逐渐增加，反应器内微生物菌群越来越活跃，微生态结构越来越复杂。这一结果与其他研究存在一定差异，在已有的研究中，多数配水或采用生活污水启动部分亚硝化的试验中长期驯化后群落多样性下降[26]。本研究微生物多样性逐渐增加的原因可能是由于猪场沼液成分复杂，接种泥群落较为单一等因素。

表3 样品微生物群落丰富度和多样性指数Table 3 Sample microbial community richness and diversity index

2.3.1 门水平上微生物分析

从14组样品中共检测出45种已知菌门，主要门水平菌群结构及分布如下图4所示。反应器内主要菌门有5种，接种污泥中，Chloroflexi（绿弯菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）相对丰度较高为优势菌门，Acidobacteriota（酸杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）相对丰度偏低，其中Chloroflexi、Firmicutes、Proteobacteria在亚硝化池中的相对丰度分别为22.24%、18.94%、17.15%，在膜池中的相对丰度分别为18.52%、23.07%、18.79%，Chloroflexi、Firmicutes分别为亚硝化池和膜池内的第一优势菌门。随着反应的进行，部分亚硝化反应成功启动及稳定运行后，门水平上的菌群结构发生了变化，Proteobacteria在整个启动阶段中相对丰度逐渐升高，亚硝化池内反应启动的第22天，Proteobacteria相对丰度达到30.59%，为启动成功后反应器内的优势菌门，反应稳定阶段Proteobacteria相对丰度有所波动，但依然保持在反应器的优势，稳定运行的第40天，Proteobacteria相对丰度维持在30.64 %。大部分硝化菌典型的AOB和NOB，如Nitrosococcus、Nitrosomonas和Nitrotoga、Nitrobacter、Nitrococcus都属于该菌门，所以Proteobacteria[27-28]是活性污泥系统中的主要脱氮菌。Proteobacteria相对丰度的增加，原因可能是随着AOB相对丰度的增加升高而升高。与接种污泥对比，部分亚硝化启动成功污泥样品中Bacteroidota的菌群相对丰度也有所增加，在亚硝化池和MBR池中由初始相对丰度1.85%、1.92%上升至7.83%、8.28%。而原来在接种污泥中占据优势的Chloroflexi、Firmicutes呈现下降趋势，接种污泥中相对丰度较低的Acidobacteriota、Actinobacteria相对丰度也逐渐降低，但与其他3种菌门相比，Firmicutes在2个池内的启动阶段相对丰度分别下降至13.67%、11.24%，在稳定运行阶段稍微有所上升，最终稳定至14.69%、14.47%。已有的研究表明，Chloroflexi在污泥中具有良好的脱氮除磷作用，常存在于菌胶团内部，为颗粒污泥的形成提供骨架支撑的作用[29]。也有文献报道认为Firmicutes与脱氮相关，在有氧或缺氧的环境中能够进行硝化、反硝化过程[30]。由此可见随着反应的进行，不同阶段的菌群丰度在门水平上存在明显差异，微生物的群落结构随着部分亚硝化的成功启动在系统内的迁移转化。

2.3.2 属水平上微生物分析

从14组样品中共检测出1007种菌属，成功启动部分亚硝化过程中，各样品中前10位菌属丰度变化如图5a所示。接种污泥的优势菌群主要是Clostridium_sensu_stricto和Turicibacter在亚硝化池和膜池中的相对丰度分别为7.72%、6.4%和6.4%、4.96%，随着反应的进行，相对丰度明显降低，在稳定运行阶段的亚硝化池和MBR池的相对丰度分别为3.34%、3.10%和2.04%、1.95%。

污泥中NOB的主要类型Nitrospira和Nitrolancea[31]，接种后在亚硝化池和MBR池内相对丰度分别为1.2%、0.82%和0.57%、0.54%，随着反应的进行，Nitrospira呈先上升后下降的趋势，与水质指标的变化趋势相符，部分亚硝化成功启动后2个池体中Nitrospira比例仅为0.94%、0.66%，并未有明显的增长，而Nitrolancea的相对丰度在整个运行过程中逐渐降低，在稳定运行的第40天降低至0.22%、0.23%；污泥中AOB的主要类型Nitrosomonas，在启动阶段的亚硝化池内相对丰度分别是D1（0.45%）、D8（1.28%）、D16（4.89%）、D28（6.66%），呈显著上升的趋势，这与MBR池的变化趋势相符，启动阶段在MBR池内Nitrosomonas的相对丰度由原来的0.29%增长为5.59%。该现象表明，部分亚硝化成功启动后，Nitrosomonas成为反应器内的优势菌属。

如图5b所示，启动初期NOB的相对丰度明显高于AOB，在反应进行的不同阶段AOB呈现上升的趋势，NOB的相对丰度逐渐下降，在提高进水氨氮浓度即提高FA浓度后（第11天）AOB和NOB的相对丰度明显提高，亚硝化池内AOB增加23.07倍，NOB增加5.39倍，AOB/NOB比值由0.26提高至1.68，说明FA浓度增加促进了AOB和NOB相对丰度的增加，且AOB的生长速率高于NOB。部分亚硝化启动成功后，AOB占据主要优势，NOB整体呈先升后降的趋势，稳定运行后第40天，在亚硝化池和MBR池内AOB/NOB比值分别为4.85、5.07，说明AOB在启动成功后的部分亚硝化中占据主要优势，AOB/NOB比值的提高促进了NO2--N的积累。上述结果也与AOB与NOB活性结果基本一致，从属水平上显示了部分亚硝化的成功启动。

值得注意的是，图5a显示在接种污泥中检测出Zobellella的相对丰度极低，基本检测不到但在启动成功后的污泥中，Zobellella的相对丰度逐渐显现，在亚硝化池和MBR池内所占比例分别为3.8%、3.31%。有研究发现，Zobellella是异养硝化-好氧反硝化菌，具有高效的脱氮性能，能够同时去除氨氮和硝酸盐氮，但目前对该菌的报道较少[32-33]，说明反应器内还同时存在其他反硝化反应作用于氨氮的去除过程中。另外，反应过程中，Subdivision5_genera_incertae_sedis和Smithella的相对丰度也略有增加，亚硝化池内由0.02%、0.03%增加至0.6%、0.63%，在MBR池内由0.02%、0.02%增加至0.92%、0.4%。

2.3.3 运行参数对微生物群落分布的影响

图6a给出了不同阶段亚硝化池、膜池菌群结构分布的PCA分析结果，结果表明同一天的亚硝化池、膜池样品之间的菌群结构相似，各阶段微生物群落体现出逐步演替的规律。样品D1、D1-M，样品D22、D22-M及样品D40、D40-M之间距离较远，说明接种污泥、部分亚硝化启动阶段及部分亚硝化稳定运行阶段菌群结构存在差异。样品D16、D16-M，样品D22、D22-M，样品D34、D34-M之间距离较近，说明反应启动阶段及稳定运行前期菌群结构差异较小。通过冗余分析研究了主要控制参数对微生物群落结构的影响，如图6b所示，冗余分析图揭示了NAR、T、FA及NO2--Neff/ NH4+-Neff是驱动微生物群落分布变化的重要因素，由于FA和温度的升高，提升了系统NAR，进而实现了出水亚硝酸盐与氨氮的比值。试验初期（D1、D8）具有较低的FA和温度，不利于亚硝酸盐氮的积累；试验运行第22～40天污泥样品，其微生物群落分布有利于亚硝酸盐的积累。

3 结 论

1）在常温环境下（22～33 ℃），控制pH值为8.0±2.0，溶解氧为0.2～0.5 mg/L，成功启动了部分亚硝化，当进水NH4+-N浓度为400 mg/L左右时，氨氧化率在50 %左右，出水的NO2--N和NH4+-N浓度分别为（197.68±27.51）、（215.61±33.91）mg/L，比值稳定在1.1∶1，出水的NO3--N浓度逐渐降低最终稳定在30 mg/L左右，NO2--N积累率最高达到87.95%，实现了稳定的NO2--N的积累。

2）提高反应器内NH4+-H的进水浓度，氨氧化细菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）的活性明显大幅度上升，稳定运行后，其活性一直维持在（0.4±0.02） g/(g·d)，AOB的活性与亚硝酸盐氧化细菌（Nitrite Oxidizing Bacteria，NOB）的活性在反应过程中均呈上升趋势，但是AOB的增幅要远高于NOB。

3）部分亚硝化启动成功后，Proteobacteria成为优势菌门，属水平上NOB的主要类型Nitrospira并未有明显的增长；AOB中Nitrosomonas在启动阶段相对丰度呈显著上升的趋势，在亚硝化池内从0.45 %升高至6.66 %。

4）亚硝化池和膜池中污泥菌群结构相似，NO2--N积累率、水温、游离氨及NO2--Neff/NH4+-Neff（eff表示出水）是微生物群落分布变化的主要影响因素，较高的游离氨浓度和水温，促进亚硝酸盐积累。