玉米种子发芽生理和抗氧化系统对砷胁迫响应的基因型差异及其机制研究

邹峁雁 韩昊展 谢永娟 万田英 涂书新

(1华中农业大学资源与环境学院，湖北 武汉 430070；2土壤环境与污染修复湖北省重点实验室，湖北 武汉 430070)

随着我国经济社会的迅速发展，工业废水排放、矿产资源开发以及农药化肥的不合理使用等导致农田重金属污染问题日益显现[1]。砷是我国土壤污染的主要特征污染物之一，广东、湖南、湖北、云南和贵州等地均存在不同程度的砷污染[2-3]。根据《全国土壤污染状况调查公报》调查结果显示，截止2013年底，全国砷污染点位超标率已达到2.7%[4]，是仅次于镉的污染元素。砷在土壤中易积累、难降解，且随着作物的生长，土壤中的砷被不断吸收并通过食物链进入人体，对农田生态系统和人体健康构成严重危害。

目前，国内外主要利用物理、化学、植物等方式进行土壤砷污染修复[5-7]。但物理、化学修复因费用较高，难以大面积推广应用[5]。植物修复采用超积累植物富集土壤中的砷，或采用耐砷性强、且低吸收植物以保障农产品中砷含量达到安全标准。研究发现，植物对砷的吸收、积累、敏感程度受自身遗传因素的控制，其外部形态及内部结构存在差异，导致不同植物甚至同一植物的不同品种对重金属吸收、积累能力有较大差异[6-7]。Srivastava 等[8]研究了18 种蕨类植物及4种蜈蚣草的砷累积特性，并筛选出3 种潜在的砷污染修复植物。熊双莲等[3]从196 个芥菜型油菜品种中筛选出2 个低吸收基因型、15 个砷排异基因型、5 个砷敏感基因型油菜品种。杜彩艳等[9]采用田间试验，从8个玉米品种中筛选出3 个As、Pb、Cd 复合污染低积累的品种。陈菲[10]和竺朝娜[11]研究发现，植物成熟期耐砷性能与苗期结果一致，证实了可通过苗期耐砷性来评价植物或品种间砷耐性的差异，从而筛选耐砷性强且砷吸收量低的植物，在中、轻度砷污染土壤(≤40 mg·kg-1)上种植，可有效降低农产品的砷污染风险。

玉米(Zea maysL.)是世界上主要的作物之一，每年有约967 亿t 玉米被用于食品、农业种植及工业生产[12]。在砷污染，尤其是中、高浓度砷污染土壤上种植玉米，会导致植株生长减缓，根系养分和水分吸收困难，叶片失绿发黄，光合作用减弱，植株矮小，最终导致玉米籽粒产量受抑制，同时使玉米籽粒砷含量超标[13]。目前有关砷胁迫对不同玉米品种种子萌发、幼苗生长影响的相关研究较少。因此，本研究拟通过水培试验，以20 份主栽玉米品种为研究对象，通过研究砷胁迫对玉米种子萌发、幼苗生长、抗氧化酶活性和相关基因表达的影响，探讨不同玉米品种对砷吸收、积累的差异性，筛选不同砷敏感型、耐受型玉米品种，旨在为中、轻度砷污染农田玉米生产提供砷耐受型种质资源，为提高玉米生长的安全性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试20 个玉米品种信息如表1所示，种子均由中国科学院亚热带农业生态研究所提供。

表1 供试玉米品种及栽种地区Table 1 Maize seed and its culture region

1.2 试验设计

在预试验的基础上，选用0.5 mg·L-1的砷(NaAsO2)溶液对20 个品种的玉米种子进行处理。选取健康饱满的玉米种子用10% H2O2(v/v)消毒15 min，自来水冲洗干净后用蒸馏水再冲洗3 次以上，将种子用湿润纱布包裹置于托盘12 h 后，播在铺有细砂(预先消毒)的培养盘中，每品种均匀放入15 粒种子，处理组喷施含0.5 mg·L-1砷的营养液(营养液组分:硝酸钙945 mg·L-1，硝酸钾607 mg·L-1，磷酸铵115 mg·L-1，硫酸镁493 mg·L-1，铁盐溶液2.5 mg·L-1，微量元素5 mg·L-1，pH 值6.0)，同时以不含砷的营养液喷施作为对照(CK)，每处理重复3 次，各处理每天喷施相应营养液3～5 次以保持细沙润湿。

待玉米幼苗长至两叶一心时，选择大小一致的幼苗进行水培试验。水培试验在人工气候控制室内进行，室内条件为温度26℃，相对湿度70%，光照条件14 h 冷白荧光光源、10 h 无光源，灯管的平均光子通量密度820 μmol·m-2·s-1。处理组施用含0.5 mg·L-1砷的改良霍格兰营养液(相比于霍格兰营养液，磷浓度减半)，CK 施用改良霍格兰营养液，每处理均重复3 次。营养液2 d 更换1 次，培养20 d 后取样。

取样时将植物用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干水分后立即称量鲜重、测量根茎长，然后将植物样分为两部分:一部分样品放入-80℃超低温冰箱中保存待测各项生理指标等，另一部分样品分成地上部和地下部，105℃杀青后于65℃烘48 h 至恒重后备用。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 种子发芽势及发芽率 发芽期间，每天观察种子的发芽情况，以种皮上可见初生根作为突起标志，以胚根长0.2 cm 作为萌芽标志，分别于第3 天观察突起的种子数量，于第7 天观察发芽的种子数量[14]:

1.3.2 植物根长、株高及干重 于砷处理20 d 后用毫米尺测量每株植物样品的主根长度和株高，杀青烘干至恒重后称量每株植物的干重[14]。

1.3.3 植株砷含量 植物鲜样用HNO3＋HClO4消化后，采用AFS-8510 原子荧光光度计(北京海光)测定[14]。根据公式计算砷转运系数:

1.3.4 生理指标 抗氧化酶系统指标测定:取叶片鲜样，用磷酸钠缓冲液制备酶提取上清液，使用南京建成科技有限公司试剂盒分别测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性。

抗氧化非酶系统指标测定:取叶片鲜样，用5%三氯乙酸制备非酶提取物上清液，丙二醛(malondialdehyde，MDA) 含量测定采用TBA 比色法[14]，谷胱甘肽(glutathione，GSH) 和抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)含量使用南京建成科技有限公司试剂盒测定。

1.3.5 基因表达 将存于-80℃冰箱的最耐受型品种与最敏感型品种新鲜样品叶片送至上海美吉生物公司进行基因表达检测，利用生信云平台(I-Sanger)进行转录本表达量差异分析。

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0 和Microsoft Excel 2019 软件进行数据处理，利用邓肯数法对处理均值进行比较。样本的聚类分析为Q 型，采用最远邻元素法进行分析。

2 结果与分析

2.1 砷处理对玉米种子发芽势和发芽率的影响

由图1和表2可知，与CK 相比，在砷处理条件下，20 个供试玉米品种的发芽势和发芽率差异明显。处理组的发芽势在23.33%～93.33%之间，20 个供试玉米品种的均值为61%，变异系数31%；发芽率在36.67%～96.67%之间，20 个供试玉米品种的均值为72%，变异系数23%。由表2可知，20 个供试玉米品种中，有13 个玉米品种的发芽势和发芽率较CK 下降，其中蠡玉6 号和三北89 的发芽势和发芽率下降最为明显，发芽势分别较CK 下降63.34 和22.22 个百分点，发芽率分别较CK 下降33.34 和23.33 个百分点；仅康农玉999 的发芽势与发芽率均较CK 提高，分别提高10.47 和12.18 个百分点。。

2.2 砷处理对玉米幼苗生长的影响

由表2可知，与CK 相比，砷处理总体对不同玉米品种的根长、株高影响较小。处理组的根长介于11.75～23.71 cm 之间，20 个供试玉米品种的均值为19.10 cm，变异系数18%；株高介于27.50～58.86 cm之间，均值为48.22 cm，变异系数14%。由图2和表2可知，有14 个品种根长的处理/CK 比值介于0.7～1.0之间，说明砷处理对大部分参试玉米品种的根部生长无影响或有轻微抑制作用；仅有4 个品种的根长在处理组较CK 降低30%以上，其中惠玉908 的根长在砷处理条件下较CK 下降51%。可见砷处理对这4 个品种的根部生长抑制作用较明显。另有2 个品种在处理组的根长高于CK，其中绵单1273 增加最明显，达到4%，说明砷处理对于这2 个品种根部生长有轻微的促进作用。有14 个品种株高的处理/CK 比值介于0.7～1.0 之间，说明处理组的株高整体较CK 略有降低；其余6 个品种在处理组的株高均高于CK，其中正大999在处理组的株高比CK 增加14%。综合来看，有13 个品种的根长、株高均较CK 降低，绵单1273 的根长、株高均较CK 增加。可见砷处理对大部分玉米品种的株高有轻微抑制作用或无影响，对少数品种有轻微促进作用。

由表2可知，砷胁迫对不同玉米品种干重影响差异较大。处理组干重介于0.21～0.57 g/株之间，20 个供试玉米品种的均值为0.39 g/株，变异系数27%。由图3和表2可知，有10 个玉米品种的处理组干重高于CK，其中登海605 增加最明显，处理组干重相比于CK增加了183%。其他10 个玉米品种在处理组的干重均低于CK，平均降低20%，其中三北89、科玉1108、康农玉007 在处理组的干重较CK 下降幅度大于30%，可见砷处理对这3 个品种有较强的抑制作用。

表2 砷处理供试玉米种子及植株生长的影响Table 2 Effects of As treatment on germination of maize seed and growth of plants

2.3 砷处理对玉米植株砷含量的影响

由表2可知，砷处理组地上部砷含量介于0.51～13.05 mg·kg-1之间，20 个供试玉米品种的均值为6.82 mg·kg-1，变异系数48%。根部砷含量介于20.00～446.07 mg·kg-1之间，20 个供试玉米品种的均值为220.01 mg·kg-1，变异系数43%。进一步分析地上部砷含量发现，低于3 mg·kg-1的玉米品种有科玉1108和成单808 号，高于9 mg·kg-1的玉米品种有青青009、蠡玉6 号、登海9 号、联创808。20 个供试玉米品种砷转运系数介于0.016～0.070 之间，其中美加303、敦玉518、科玉1108、同玉609 等4 个品种的砷转运系数最低，介于0.016～0.018 之间；正大999、联创808 玉米品种的砷转运系数较高，均不低于0.060。

2.4 主成分分析

对20 个玉米品种的12 个指标进行主成分分析，结果如表3所示，提取特征值大于1 的前4 个主成分累积贡献率达到81.557%，基本能够反映全部指标的大部分信息，说明该结果符合主成分分析要求，可以用这4 个主成分来代替12 个指标对20 个玉米品种的耐砷性能进行评价。

第1 主成分特征值最大，为4.1，贡献率为34.163%，载荷较高且为正的指标有株高处理/CK、处理株高，其特征向量值分别为0.728、0.803，这些指标均与株高有关。载荷负向较高的有发芽势处理/CK、发芽率处理/CK、处理发芽势、处理发芽率，特征向量分别为-0.712、-0.726、-0.846、-0.769，这些指标均与发芽状况有关。因此第1 主成分可以视为株高和发芽状况的综合指标，株高与发芽状况的特征向量数据相反，发芽状况制约着株高。

表3 20 个供试玉米品种种子发芽生理指标的主成分分析Table 3 Principal component analysis of germination and physiology indicators of twenty maize varieties

第2 主成分特征值为2.259，贡献率为18.824%，特征向量正向较高的指标有砷转运系数、干重处理/CK、处理干重，其特征向量值分别为0.712、0.602、0.554。因此第2 主成分可以视为砷转运系数和干重的综合指标。

第3 主成分特征向量正向较高的指标有根长处理/CK、处理根长，其特征向量值分别为0.656、0.659。因此第3 主成分可以视为根长等方面的综合指标。

第4 主成分特征向量正向较高的指标有处理发芽率、地上部砷含量，其特征向量值分别为0.488、0.448。载荷负向较高的指标是处理干重，其特征向量值为-0.473。因此第4 主成分可以视为处理发芽率、地上部砷含量和处理干重的综合指标，处理干重特征向量为负，所以处理干重制约着地上部砷含量和处理发芽率。

为了更好地评价不同玉米品种的耐砷性能，利用指标特征值和各主成分的特征值计算各主成分的对应表达式系数(表达式系数=指标特征值/SQRT 主成分特征值)，得到4 个主成分的表达式，并进一步将4 个主成分表达式转化为1 个综合评价表达式F(各主成分表达式系数乘以其贡献率之和再除以总贡献率):

F =-0.111X1-0.119X2＋0.221X3＋0.055X4＋0.199X5＋0.115X6-0.119X7-0.081X8＋0.115X9＋0.153X10＋0.209X11＋0.249X12

式中，X1～X12分别表示试验品种各指标标准值，分别为发芽势处理/CK、发芽率处理/CK、干重处理/CK、根长处理/CK、株高处理/CK、处理干重、处理发芽势、处理发芽率、处理根长、处理株高、地上部砷含量、砷转运系数。将12 项指标值进行标准化处理，代入综合评价表达式，计算各品种的综合评价值并进行排名[15]。根据综合评价值排名结果，前5 名分别为康农玉999、康农玉007、科玉1108、同玉609、成单8008号，可将其视为耐受型品种，后5 名分别为正大999、登海605、登海9 号、三北89、绵单1273，可将其视为敏感型品种，其余品种可视为普通型品种。

2.5 聚类分析

以主成分分析中的12 个指标对20 个玉米品种进行Q 型聚类分析[16]。由图4可知，在欧氏距离为10处划分，可将20 个品种划分为3 类，即耐受型、普通型和敏感型。耐受型品种共计4 个，由康农玉999、腾龙168、山单9 号、成单808 号组成；普通型品种共计7个，由青青009、康农玉007、敦玉518、科玉1108、同玉609、惠玉908、林单3121 组成；敏感型品种共计9 个，由蠡玉6 号、正大999、登海605、登海9 号、康农玉108、三北89、美加303、绵单1273、联创808 组成。

主成分分析与聚类分析2 种方法所筛选出的耐受型和敏感型品种基本一致。结合2 种筛选方法得到耐受型品种有2 个，分别为康农玉999、成单808 号，得到敏感型品种5 个，分别为正大999、登海605、登海9号、三北89、绵单1273，其余13 个品种均为普通型品种。进一步对比12 项测试指标，确定最耐受型品种为康农玉999，最敏感型品种为三北89。

2.6 砷处理对玉米抗氧化系统的影响

本研究进一步对耐受型品种康农玉999 和敏感型品种三北89 进行抗氧化系统分析，结果如表4所示。耐受型品种康农玉999 在砷处理条件下，3 种抗氧化酶活性均低于CK，其中CAT、POD 活性分别较CK 降低10%和7%，差异不显著，而SOD 活性显著降低71%；其抗氧化非酶物质MDA、GSH、AsA 含量则均显著高于CK，分别增加26%、21%、114%。敏感型品种三北89 在砷处理条件下其SOD、CAT 活性分别较CK增加23%、42%，POD 活性与CK 无显著差异；其抗氧化非酶物质GSH、AsA 含量分别较CK 增加125%、39%，而MDA 含量则较CK 降低50%。

表4 不同砷抗性玉米品种的抗氧化、氧化物质含量Table 4 Antioxidant and oxidant content in different arsenic resistant maize varieties

2.7 玉米样品基因表达分析

对筛选所得耐受型玉米品种康农玉999 和敏感型玉米品种三北89 进行基因表达分析。根据遗传中心法则，遗传物质由DNA 经RNA 最终传递给蛋白质，所以通过分析mRNA(转录本)的表达量即可得知基因表达情况[17-18]。统计2 个样本的转录本表达量，共计存在138 270 个差异(图5)，其中4 852 个为显著性差异。从Pfam 数据库中获得表达量有显著性差异的转录本功能注释表，以“ars”作为关键词进行全面搜索[19-20]，获取到5 个与植物抗砷性相关的转录本(表5)，包括4 个与泵砷膜蛋白(ArsB)合成相关的转录本和1 个与亚砷酸盐-激活ATP 酶(ArsA)合成相关的转录本。

由表5可知，与耐受型品种康农玉999 相比，敏感型品种三北89 有4 个抗砷相关转录本表达量出现明显上升，包含3 个ArsB 相关转录本和1 个ArsA 相关转录本，只有1 个ArsB 相关转录本表达量出现轻微下降。ArsA 是一种依靠砷激活的ATP 酶，ArsB 是一种内膜蛋白，可为砷离子排出细胞提供通道，二者共同作用可促进砷的排出[21]。根据以上结果，推测耐受型品种因为植物体内砷含量低，不需要通过主动运输将砷离子排出体外，所以相关转录本表达量较低；而敏感型品种因其对砷敏感，所以体内砷含量较高，相关基因得到激活进而转录形成转录本，建立了排砷机制，以减少砷对自身的危害。

表5 耐受型品种康农玉999 和敏感型品种三北89 的转录本表达量差异Table 5 Differential expression of transcripts of tolerant cultivar Kangnongyu 999 and sensitive cultivar Sanbei 89

3 讨论

Javed 等[22]发现多数植物在重金属胁迫环境中逐渐形成了避性机制和耐性机制。外界环境胁迫对植物的影响可以通过植物的形态学特征表现出来[3]。营养液中砷等重金属胁迫的存在会破坏细胞膜的结构和功能[23]，影响种子的细胞分裂，对种子的发芽势和发芽率有明显影响。植物的生长参数如株高、根长、生物量等易对各种胁迫敏感，从而被用作植物对金属毒性的耐受性指标[3]。本研究通过考察20 个玉米主栽品种在0.5 mol·L-1砷胁迫条件下，发芽势、发芽率、根长、茎长、干重等5 个生长参数及茎部和根部砷含量来初步筛选玉米的耐受型和敏感型品种。结果显示，砷胁迫条件下各品种的生长参数差异较大，各品种玉米种子的发芽势、发芽率、干重、根长以及茎长的处理/CK 比值在1 左右均有分布。由此可知，部分供试玉米品种的生长不仅未受到砷胁迫的抑制，反而被微量砷处理刺激了植物的生长发育[24]，这可能是因为少量的砷可以促进部分玉米品种对某些营养元素的吸收，从而促进玉米的生长[25-26]。王效瑾等[27]有关小麦幼苗根系形态对镉胁迫的响应研究也得出类似结论；而过量的砷使叶绿素的合成受阻，抑制光合作用[28]，并导致叶面蒸腾速率下降，阻碍作物对水分的吸收及水分由根部向地上部的运输[29]。从而使得部分玉米品种的生长受到限制。在采用多项指标进行综合评价分析时，由于指标数量多而且指标之间相互关联，导致分析工作比较困难。主成分分析可将多个主要指标转化为较少的几个综合、相对独立的主成分，被广泛应用于多项指标综合评价分析中[30]。本研究应用主成分分析方法，将20 个玉米品种的12 个指标简化成4 个主成分，这4 个主成分累计方差贡献率达81.557%，根据综合评价值对不同玉米品种的抗砷性能排序。同时应用Q 型聚类分析将20 个品种划分为耐受型、普通型和敏感型3 类。结合2 种筛选方法得到耐受型品种2 个，敏感型品种5 个，普通型品种13 个，其中最耐受型品种为康农玉999，对比5 个敏感型品种的12 项指标确定最敏感型品种为三北89。

三北89 地上部和根部砷含量分别为6.51、279.30 mg·kg-1，其地上部、根部砷含量分别是康农玉999 相应部位砷含量的2.0 倍、2.3 倍。敏感型品种三北89 和耐受型品种康农玉999 的转运系数分别是0.023 和0.026。由此可见，相比耐受型品种，敏感型品种对砷的吸收量更大。对二者进行基因表达分析可推测，三北89 对砷的吸收存在防御机制致使体内砷含量较高，过高的砷含量导致三北89 体内与排砷相关蛋白基因被激活，对应转录本得以进行表达。而康农玉999 对砷的吸收能力较低，所以其体内砷含量相对较低，与砷排出相关蛋白基因表达不明显，尤其是为排砷提供ATP 的ArsA 表达量较少。

在重金属胁迫下植物体内活性氧自由基不断积累增加，导致细胞膜受损[31]，同时，植物启动抗氧化防御机制，合成抗氧化系统如SOD、CAT、POD、GSH、AsA以清除金属的毒性作用[32]。本研究对筛选出的耐受型品种康农玉999 和敏感型品种三北89 进行抗氧化系统分析，结果表明，与CK 相比，砷胁迫下耐受型品种康农玉999 的SOD、CAT、POD 活性均降低，敏感型品种三北89 则相反；在非酶物质方面，砷胁迫下耐受型品种康农玉999 的MDA、GSH、AsA 含量升高，敏感型品种三北89 的MDA 含量降低，而GSH、AsA 含量升高。这可能是由于敏感型品种体内砷含量较高，导致其体内抗氧化酶活性升高，以清除砷胁迫下过量活性氧，维持活性氧的代谢平衡、保护膜结构[33]，使得MDA 含量下降；耐受型品种由于本身具有一定的阻碍能力，体内砷含量较低，所以0.5 mol·L-1砷胁迫对体内抗氧化酶CAT 和POD 活性的促进作用不显著，导致MDA 含量升高。此外，砷积累可增加植物对磷素的吸收，同时促进植物体内GSH 含量上升[34]，并且AsA-GSH 循环可清除过量H2O2[35]，同时提高AsA 的含量。由于在相同外源砷浓度处理下，耐受型与敏感型品种体内的砷浓度不同，因此，耐受型与敏感型品种在砷胁迫下有不同的抗氧化系统活性。

4 结论

本研究分析了20 个玉米品种种子的发芽生理和抗氧化系统的差异，表明在砷胁迫下，玉米品种的发芽势、发芽率、干重、根长、株高的处理/CK 及砷转运系数变异较大，小部分品种表现出低浓度砷轻微刺激生长的现象，而惠玉908 受到明显抑制。通过主成分分析和聚类分析，筛选出耐受型品种2 个，敏感型品种5个，其中康农玉999 为最耐受型品种，三北89 为最敏感型品种，表现为与CK 相比，砷胁迫下耐受型品种康农玉999 的发芽势、发芽率、干重均提高，抗氧化酶SOD、CAT、POD 活性均降低，抗氧化非酶物质MDA、GSH、AsA 含量均增加；而敏感型品种三北89 砷含量高于耐受型康农玉999，与CK 相比，发芽势、发芽率、干重均较CK 降低，抗氧化酶SOD、CAT、POD 活性均升高，抗氧化非酶物质含量总体上升。通过检测基因表达水平推测，耐受型品种主要通过抑制自身对砷的吸收而减弱其发芽生长中所受到的砷毒影响。本研究仅进行了苗期试验，为进一步了解这2 个玉米品种在砷胁迫条件下的生长情况，可研究各生长部位尤其是玉米籽粒的砷含量变化，并落实到实际生产中，并进一步在砷污染土壤上进行全生育期试验。