我国花生土壤黄曲霉菌分布与产后花生黄曲霉毒素污染相关性研究

杨博磊 耿海荣 王 刚 张晨曦 李 丽 聂呈荣 邢福国 刘 阳

(1中国农业科学院农产品加工研究所/农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193；2佛山科学技术学院，食品科学与工程学院，广东 佛山 528231)

花生营养价值极高，含有人体必需的8 种氨基酸，同时具有抗衰老，保持皮肤滋润细腻等功能，被誉为“长生果”，同时花生中脂肪含量高达47%～59%，是我国乃至世界的重要油料作物[1]。目前，全球已超过100 个国家种植花生，世界花生的种植面积约0.23 亿hm2，年总产量约3 500 万t；我国作为花生种植和生产大国，花生种植面积约0.05 亿hm2，年产量约1 700 万t[2]。然而花生在种植、收获、储藏和加工过程中极易受黄曲霉毒素污染，国内及国际对我国花生及其制品黄曲霉毒素超标现象时有报道。据统计，2015—2018年国家及各省(市)市场监督管理局通报我国食品真菌毒素超标事件602 起，其中花生黄曲霉毒素超标事件372 起，占62%；2015—2018年我国出口欧盟食品和饲料真菌毒素违例事件241 起，其中花生黄曲霉毒素超标事件223 起，占93%。黄曲霉毒素污染严重制约了我国花生产业的健康发展。

黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)主要是由黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉菌(A.parasitica)产生的有毒次级代谢产物，具有剧毒性、致癌性和致突变性，可污染包括花生在内的几乎所有农产品[3]。AFT 的存在形式主要有黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)，其毒性依次为AFB1＞AFG1＞AFB2＞AFG2，其中AFB1被联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为Ⅰ级致癌物[4-5]。基于AFT 的危害，世界各地针对花生及其制品中AFT 含量也制定了严格的限量标准，例如，我国对AFB1限量标准为≤20 μg·kg-1；国际食品污染物法典委员会(Codex Committee on Contaminants in Food，CCCF)对AFT 限量标准为≤15 μg·kg-1；欧盟对AFT 限量标准为≤4 μg·kg-1，AFB1为≤2 μg·kg-1；美国对AFT 限量标准为≤20 μg·kg-1，加拿大对AFT限量标准为≤15 μg·kg-1，澳大利亚/新西兰对AFT 限量标准为≤15 μg·kg-1，日本对AFT 限量标准为≤10 μg·kg-1[6]。研究发现，土壤类型可显著影响花生AFT污染，淋溶土壤中花生受AFT 污染的风险显著高于变性土壤，黏土土壤中花生受AFT 污染风险显著高于沙土土壤[7-8]。土壤中存在丰富的微生物，而花生作为一种地上开花地下结果的作物，与土壤中的微生物直接接触，从而易受微生物侵染。国内外已经开展了花生土壤中微生物菌群分布特征研究，并根据土壤特征制定有针对性的防控措施[9-13]。戴显红[14]研究发现花生土壤中芽孢杆菌、乳球菌等能有效抑制黄曲霉菌生产和产毒，从而降低花生产后AFT 污染风险。朱婷婷[15]和张初署[16]研究发现，土壤中不产毒黄曲霉菌能够抑制产毒黄曲霉菌生长和产毒，同时根据花生土壤中黄曲霉菌的分布、产毒特征等信息，评估了我国不同产区花生产后AFT 污染的风险，但并未进行实际监测。

本研究从我国4 个典型花生产区黄河流域产区(河北保定)、西北产区(新疆吐鲁番)、长江流域产区(湖北黄冈、四川南充)和东南沿海产区(广东湛江)采集花生土壤样品124 份，进行花生土壤黄曲霉菌分布及产毒能力研究，并在所在产区收集花生样品64 份开展产后花生AFT 污染调查，探究花生土壤中黄曲霉菌分布及产毒能力与产后花生AFT 污染的相关性，以期为我国花生AFT 污染监测预警和防控提供理论依据，这对提高我国花生质量安全和促进我国花生产业健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2019年从我国黄河流域产区(河北保定)、西北产区(新疆吐鲁番)、长江流域产区(湖北黄冈、四川南充)和东南沿海产区(广东湛江)4 个典型花生主产区采集花生样品64 份，土壤样品124 份，其中黄棕壤38 份(湖北黄冈和四川南充)、红壤土32 份(广东湛江)、沙壤土54 份(河北保定和新疆吐鲁番)。

DG-18 培养基，青岛海博生物技术有限公司；蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，美国Fisher 公司；黄曲霉毒素免疫亲和柱，中检环贸生物技术(北京)有限公司；AFB1标准品，青岛普瑞邦生物工程有限公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Vertical 高压蒸汽灭菌锅，台湾造鑫公司；HR3011 A2 型生物安全柜，青岛海尔特种设备有限公司；Genius 3 涡旋混合器，德国IKA 公司；Sigma1-14小型高速离心机，美国Sigma 公司；Agilent 1260 高效液相色谱，TC-C18 色谱柱，美国Agilent 公司；HF2500光化学衍生器，北京华安麦科生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤中黄曲霉菌的筛选及分离纯化 在超净工作台中称取10 g 土壤样品，倒入无菌300 mL 三角瓶中，加入90 mL 无菌蛋白胨水溶液(蛋白胨浓度为0.1%)，封口震荡30 min，静置10 min，取上清为原浓度菌悬液，取1 mL 原浓度菌悬液加入装有9 mL 浓度为0.1%的蛋白胨水溶液中，涡旋混匀，制成10 倍稀释液。所有土样按此操作依次进行10 倍稀释。取100 μL 原浓度菌悬液和稀释液，分别涂布于DG-18 平板，在28℃培养箱中倒置培养5 d，之后进行菌落计数。选取长有黄绿色孢子的黄曲霉菌或寄生曲霉菌在DG-18 平板上进行2 次分离，直至得到单个菌落。

1.3.2 黄曲霉菌的鉴定 将分离纯化的单个菌落送至青岛派森诺基因科技有限公司进行真菌钙调基因序列测序，测序结果在BLAST researches 上进行比对。

1.3.3 黄曲霉菌产毒能力分析 菌株在DG-18 培养基上28℃活化7 d，用0.1%吐温80 配制菌悬液，调整孢子浓度至107cfu·mL-1，取100 μL 孢子液接种到10 mL 产毒培养基中，28℃、200 r·min-1培养7 d，取1 mL菌悬液，加入3 mL 84%乙腈，涡旋充分混匀，取2 mL提取液依据黄曲霉毒素免疫亲和柱操作方法提取AFB1，加入23 mL 50 mmol·L-1PBS(pH 值7.4)上柱，流速控制在1～3 mL·min-1，待样品完全通过凝胶后，用10 mL 10 mmol·L-1PBS/甲醇(90/10，v/v)溶液洗涤凝胶，然后用1 mL 甲醇洗脱AFB12 次，洗脱液过0.22 μm 滤器，转移至进样瓶，用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测。

HPLC 检测条件:TC-C18 色谱柱(4.6 nm×250 mm，5 μm)，柱 温30℃，流 动 相70% 甲 醇，流 速1 mL·min-1，进样量20 μL，激发波长360 nm，发射波长440 nm，配备光化学衍生器。

黄曲霉菌产毒浓度=HPLC 检测浓度×稀释浓度

1.3.4 土壤中黄曲霉的检出率 土壤样品黄曲霉的检出率是指每个采样地样品中能够分离出黄曲霉菌的样品占总样品的百分数。

1.3.5 花生样品处理及黄曲霉毒素检测 依据GB 5009.22-2016 《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B 族和G 族的测定》[17]处理花生样品并测定黄曲霉毒素。

1.4 数据分析

采用SPSS Inc 软件进行统计分析。采用方差分析(ANOVA)对数据进行分析，采用Tukey 多区间检验确定平均值间的差异(P≤0.05)。采用Microsoft Excel 2007 制图。

2 结果与分析

2.1 黄曲霉菌的分离纯化

采用稀释法分别对河北保定、新疆吐鲁番、湖北黄冈、四川南充和广东湛江共124 份土壤样品进行黄曲霉菌和寄生曲霉菌分离、纯化，筛选获得可产黄绿色孢子菌共计203 株。

2.2 黄曲霉分子生物学鉴定

利用真菌ITS 鉴定方法，把分离纯化出的产黄绿色孢子菌株送至青岛派森诺基因科技有限公司，经过菌株PCR、PCR 产物纯化及测序，获得的测序结果于NCBI 核酸数据库中进行BLAST 数据比对分析，共筛选获得黄曲霉菌165 株，寄生曲霉0 株。

2.3 不同地区花生种植土壤黄曲霉菌分布

由表1可知，5 个取样点花生土壤中，湖北黄冈地区筛选获得的黄曲霉菌最多，为66 株，菌落数范围为0～1 700 cfu·g-1，平均值为314 cfu·g-1，检出率为61.90%；其次为四川南充，黄曲霉菌为33 株，菌落数范围为0～700 cfu·g-1，平均值为194 cfu·g-1，检出率为64.71%；广东湛江地区共筛选获得黄曲霉菌35 株，检出率为50.00%，菌落数范围为0～700 cfu·g-1；最低为河北保定，黄曲霉菌为5 株，菌落数范围为0～200 cfu·g-1，平均值为25 cfu·g-1，检出率为15.00%。表明我国南方气候潮湿地区，土壤中黄曲霉菌数量高于北方地区。

表1 不同地区花生种植土壤中黄曲霉菌分布Table 1 Distribution of A.flavus in peanut fields in different regions

2.4 不同地区花生土壤中黄曲霉产毒特征研究

根据产毒能力不同，黄曲霉菌被分为4 个水平，分别为高产毒菌(AFB1＞1 000 μg·kg-1)、中产毒菌(AFB1＞100～1 000 μg·kg-1)、低产毒菌(AFB1＞0～100 μg·kg-1)和不产毒菌(AFB1=0 μg·kg-1)[16]。由表2可知，在河北保定、新疆吐鲁番、湖北黄冈、四川南充和广东湛江5 个地区分离的黄曲霉菌种，不产毒菌所占比例分别为0%、15.38%、12.12%、27.27%和2.94%，四川南充不产毒菌所占比例高于其他地区；低产毒菌在5 个地区所占比例均相对较高，其中广东湛江低产毒菌所占比例高于其他地区；中产毒菌在河北保定所占比例最高，为60.00%，其次为广东湛江，占29.41%，四川南充所占比例最低，为21.21%；河北保定不存在高产毒菌，四川南充高产毒菌所占比例最高，为12.12%。湖北黄冈、广东湛江、四川南充和新疆吐鲁番分离的低产毒菌所占比例相对较高，而河北保定分离的中产毒菌所占比例最高。由于河北保定筛选出的黄曲霉菌数量较少，因此不能很好的体现河北保定地区土壤中黄曲霉菌的产毒特征。

表2 不同地区花生种植土壤中黄曲霉菌产AFB1 能力分布Table 2 Producing ability of AFB1 of A.flavus in peanut fields in different regions

2.5 不同地区花生受黄曲霉污染风险分析

由表3可知，5 个地区中黄曲霉平均产AFB1量以及每克土壤中产AFB1量存在较大差异。黄曲霉平均产毒量最高的地区是四川南充，为707 μg·kg-1，产毒范围是0～12 118 μg·kg-1；其次是湖北黄冈，平均产毒量为599 μg·kg-1，产毒范围是0～24 005 μg·kg-1；广东湛江地区黄曲霉平均产毒量为377 μg·kg-1；河北保定地区黄曲霉平均产毒量为172 μg·kg-1；黄曲霉平均产毒量最低的是新疆吐鲁番，为141 μg·kg-1。每克土壤中平均产AFB1量较高的地区是湖北黄冈和四川南充，达到了130 000 μg·kg-1·g-1以上；其次是广东湛江和新疆吐鲁番地区，分别为41 093 μg·kg-1·g-1和10 716 μg·kg-1·g-1；河北保定最低，为4 300 μg·kg-1·g-1。说明，湖北黄冈产后花生受AFB1污染风险最高，其次为四川南充、广东湛江和新疆吐鲁番，河北保定产后花生受AFB1污染风险最低。

表3 不同地区花生土壤中黄曲霉菌平均产AFB1 量Table 3 Quantities of aflatoxin B1 produced by A.flavus isolated among peanut fields in different regions

2.6 不同地区产后花生黄曲霉毒素污染情况分析

由表4可知，5 个地区花生样品中均检测到AFB1，检出率分别为13%(河北保定)、14%(新疆吐鲁番)、57%(湖北黄冈)、38%(四川南充)和31%(广东湛江)。河北保定、新疆吐鲁番、广东湛江和四川南充未检测到花生AFB1超标情况，湖北黄冈检测到2 份花生样品AFB1超标，超标率为10%，检出浓度分别为97.93 μg·kg-1和31.79 μg·kg-1。由此可知，湖北黄冈产后花生受AFB1污染最严重，其次为四川南充、广东湛江、新疆吐鲁番，河北保定产后花生受AFB1污染较轻。花生受AFB1污染风险分析结果与实际检测结果一致。

3 讨论

花生是我国重要的油料与经济作物，营养价值丰富，有益人体健康。我国是世界花生出口第一大国，占花生国际市场总贸易的40%以上。然而花生极易受AFT 污染，仅2018年欧盟通报我国花生AFT 超标事件就41 起，占我国出口欧盟食品和饲料违例事件的19%，AFT 已成为限制我国花生出口贸易的主要危害因子。花生中黄曲霉菌的主要来源是土壤，花生荚果黄曲霉带菌量与土壤中黄曲霉数量呈正相关性[18-20]。研究发现，我国土壤中黄曲霉菌分布有明显的地域性特征，长江流域土壤中黄曲霉菌量最多，其次为东南沿海地区，再次为黄河流域，东北地区黄曲霉菌量最少，由南到北土壤中黄曲霉菌数量逐渐减少[3，15-16]。本研究结果表明，湖北黄冈土壤黄曲霉菌带菌量最高，为314 cfu·g-1，其次四川南充为194 cfu·g-1，河北保定土壤黄曲霉带菌量最少，为25 cfu·g-1。表明我国花生土壤中黄曲霉菌落数与生态环境存在相关性，气候潮湿、温度较高的长江和东南沿海产区土壤中黄曲霉菌落数较多，气候干燥、温度较低的北方和西北产区土壤中黄曲霉菌落数较少。我国上述5 个地区花生土壤中黄曲霉菌平均菌落数范围为25～314 cfu·g-1，与国外相比，低于美国爱荷华州玉米和谷物土壤中黄曲霉菌落数(396 cfu·g-1)和美国密西西比州小麦土壤中黄曲霉菌落数(457 cfu·g-1)[21-22]，高于日本神奈川县花生土壤中黄曲霉菌落数(9 cfu·g-1)[23]，其中广东湛江花生土壤中黄曲霉菌菌落数与阿根廷玉米土壤中黄曲霉菌菌落数(100 cfu·g-1)相当[24]。

表4 不同地区产后花生AFB1 污染情况Table 4 The contaminated situation of AFB1 in harvest peanut in different regions

针对全国花生土壤中黄曲霉菌产毒能力研究，张初署[16]发现我国花生土壤中产毒菌所占比例为69%，不产毒菌所占比例最高，为31%；朱婷婷[15]发现我国花生土壤中产毒菌所占比例为79%，其中低产毒菌所占比例最高，为43%；张杏[3]发现我国花生土壤中产毒黄曲霉菌比例为85%，其中高产毒菌所占比例最高，为44%。本研究发现，花生土壤中黄曲霉菌产毒菌所占比例为87%，其中低产毒菌所占比例为52%，中产毒菌所占比例为27%。综合多次研究结果发现，我国花生土壤中产毒黄曲霉菌平均比例为70%～85%，但低、中和高产毒菌所占比例差异较大，分析可能与取样当年季节气候以及土壤类型等有关。针对个别花生产区花生土壤中黄曲霉菌产毒能力研究，朱婷婷等[25]发现湖北地区花生土壤黄曲霉平均菌落数为128 cfu·g-1，其中产毒黄曲霉菌占96%。张杏等[26]发现西南地区四川蓬安花生土壤黄曲霉平均菌落数为212 cfu·g-1，其中产毒黄曲霉菌占100%。本研究中，湖北黄冈地区花生土壤黄曲霉平均菌落数为314 cfu·g-1，其中产毒黄曲霉菌约占88%，土壤带菌量高于朱婷婷等[25]的研究结果，但产毒菌比例低于其结果；四川南充地区花生土壤黄曲霉平均菌落数为194 cfu·g-1，产毒黄曲霉菌约占73%，其中土壤带菌量与张杏等[26]的调查结果相近。

通过对不同地区花生受AFT 污染风险分析发现，湖北黄冈花生受AFT 污染风险最大，每克花生土壤中AFB1平均产量为188 086 μg·kg-1；其次为四川南充、广东湛江和新疆吐鲁番；河北保定花生受AFB1污染风险最小。这与张初署[16]研究结果一致，即通过对全国花生土壤中AFB1产量调查发现，长江流域土壤中AFB1产量最高，花生受AFT 污染风险最高。朱婷婷[15]研究发现南方产区花生受AFT 污染风险最高，其次为长江流域产区，东北产区花生受AFT 污染风险最低。河北和新疆气候环境相似，取样当年新疆未存在极端天气，气候与常年类似，然而本研究发现新疆土壤中黄曲霉菌数量是河北地区的3.04 倍，且每克土壤产AFB1量是河北的2.49 倍，同时土壤中还存在高产毒黄曲霉菌。因此新疆吐鲁番地区花生AFT 污染风险远高于河北保定地区。新疆地广人稀，花生产业潜力巨大，需更加重视花生AFT 的防控工作。

产后花生AFT 污染调查发现，长江流域的湖北黄冈和四川南充AFB1检出率较高，同时在湖北黄冈地区检测到2 份样品AFB1超标；其次为东南沿海的广东湛江，检出率为31%；河北保定和新疆吐鲁番检出率分别为13%和14%。AFB1检出率高低顺序为湖北黄冈＞四川南充＞广东湛江＞新疆吐鲁番＞河北保定。国内研究人员也开展了全国不同地区花生AFT 污染调查。李娟[27]开展中国十二省花生AFT 污染调查，南方产区花生AFT 阳性率高于长江流域产区、北方产区和东北产区，阳性率为83.15%。丁小霞[28]完成了13 个花生主产省花生AFT 污染调查，发现长江流域产区AFT 污染最为严重，东北产区最轻，AFT 污染地域特征明显。程果等[29]开展2017年花生主产区花生AFT 污染调查，发现北方产区AFT 污染风险较高，而东北产区及内蒙古未检测到花生AFT 污染。高秀芬等[30]对吉林省、河南省、湖北省、四川省、广东省和广西自治区花生样品进行AFT 污染调查，发现吉林省花生检出率最高，为67%，河南省检出率最低，为43%。本研究结果与丁小霞[22]的调查结果一致，长江流域产区及东南沿海产区由于气候等因素AFT 污染较为严重。花生AFT 检测结果与风险评估结果一致，花生土壤中黄曲霉菌带菌量越多，产毒菌比例越高，产毒能力越强，产后花生受AFT 污染越严重。

4 结论

本研究发现我国花生种植土壤中黄曲霉菌分布呈明显的地域性特征，湖北黄冈土壤黄曲霉带菌量最多，检出率最高；河北保定花生土壤带菌量最少，检出率最低。花生土壤中黄曲霉菌以中低产毒菌所占比例最高。通过对不同地区花生土壤AFT 污染风险评估发现，湖北黄冈地区花生受AFB1污染风险最高，其次为四川南充、广东湛江和新疆吐鲁番，河北保定风险最低。对不同产区产后花生AFB1检测发现，湖北黄冈产后花生AFB1检出率最高，河北保定AFB1检出率最低，花生AFB1污染检测结果与风险评估结果一致。说明产后花生受AFB1污染情况与花生土壤中黄曲霉菌的数量、产毒菌比例及产毒能力呈极强正相关性。本研究结果表明，通过对花生土壤黄曲霉菌的风险评估可预知产后花生的AFB1污染情况，以便做好防控工作，这对提高我国花生质量水平，保障我国花生消费安全具有重要意义。