具有异养硝化-好氧反硝化功能的水产养殖生物絮团菌的分离鉴定及其性能研究

李 哲，吕 剑，张宇轩，武 君，于晓斌，崔德杰

(1.青岛农业大学资源与环境学院，山东 青岛 266109；2.中国科学院烟台海岸带研究所，中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室，山东 烟台 264003；3. 鲁东大学资源与环境工程学院，山东 烟台 264025)

水产养殖过程中，未被利用的残饵以及水生动物产生的粪便直接排入水体，使养殖水体中氮素含量和有机物含量较高，造成水体富营养化。水质恶化产生的亚硝态氮等会毒害水生生物，使病害频发，增加养殖成本[1]。因此，降低养殖水体中的氮浓度是目前养殖废水处理的研究热点[2]。生物脱氮被认为是去除养殖废水中氮元素最经济有效的方式，且无二次污染[3-5]。生物絮团是由细菌、原生动物、微藻、有机碎屑等形成的絮状物质[6]，能够通过细菌的氨化、硝化、反硝化及同化作用等将水产养殖废水中的无机氮转化为自身的营养物质[7]，降低有害氮素对水体的污染，实现养殖水的循环利用，因此利用生物絮团调节水产养殖污水得到了普遍关注。

在传统的污水处理过程中，利用微生物脱氮时，硝化过程和反硝化过程必须分开进行且必须保证严格的好氧和厌氧环境[8-9]。近年来，研究人员已发现并分离出一些同步进行异养硝化和好氧反硝化的细菌[10]，突破了对传统脱氮理论的认识。在同一反应容器中，异养硝化-好氧反硝化菌在硝化作用中将氨氮转化为硝态氮或亚硝态氮甚至直接转化成氮气去除[11]，在反硝化过程中，可以将硝态氮转化成亚硝态氮最后变成气态氮脱除[12]。由于不涉及厌氧条件，减少了生物处理系统体积并且降低运行所需能量，从而降低了运行的成本，所以异养硝化-好氧反硝化菌在生物脱氮方面具有巨大的优势[13]。生物絮团是微生物的集合体，异养菌在生物絮团的脱氮功能中起着重要作用，其中异养硝化-好氧反硝化菌能同步进行硝化和反硝化作用，因此，生物絮团中的异养硝化-好氧反硝化菌有待进一步研究。

本文试验从水产养殖生物絮团分离出一株异养硝化-好氧反硝化菌，并研究温度、pH等因素对其生长状况的影响以及菌株的脱氮性能，以期增加对生物絮团中的异养硝化-好氧反硝化菌种类和性能的认识，为其在将来的应用提供理论支持。

1 试 验 方 法

1.1 培养基

0.5 g硫酸铵、2.17 g琥珀酸钠和50 mL维氏盐溶液溶解后定容至1 L，配成富集培养基；6.5 gK2HPO4·3H2O、2.5 gMgSO4·7H2O、2.5 gNaCl、0.05 gFeSO4·7H2O和0.04 gMnSO4·H2O溶解后定容至1 L，配成维氏盐溶液[14]。异养硝化培养基、好氧反硝化培养基、异养硝化好氧反硝化培养基均含有3.38 g琥珀酸钠、50 mL维氏盐溶液、950 mL H2O，溶液pH为7.0。此外，异养硝化培养基含有0.5 g (NH4)2SO4，好氧反硝化培养基(亚硝酸盐培养基)含有0.49 g NaNO2，好氧反硝化培养基(硝酸盐培养基)含有0.61 g NaNO3，异养硝化好氧反硝化培养基(氨氮亚硝态氮培养基)含有0.25 g (NH4)2SO4、0.25 g NaNO2，异养硝化好氧反硝化培养基(氨氮硝态氮培养基)含有0.25 g (NH4)2SO4、0.31 g NaNO3，以上培养基均置于高压灭菌锅中灭菌[15]。

1.2 分析方法

1.3 菌株的分离鉴定

取罗非鱼养殖系统中的生物絮团至富集培养基，在摇床中以温度28℃，转速170 r/min培养72 h，然后从中吸取10%至新的培养基，重复3次。取1 mL溶液，以10倍浓度梯度将溶液分别稀释至10-8、10-9、10-10，从中各取0.1 mL涂布于固体异养硝化培养基，选出优势菌落摇床培养48 h，然后用接种环划线分离接种到异养硝化固体培养基上，连续纯化3次得到单菌。将分离得到的单菌接种到异养硝化液体培养基，若氨氮浓度降低则菌株有异养硝化功能，后将菌株分别接种到亚硝酸盐反硝化培养基和硝酸盐反硝化培养基中，若亚硝态氮和硝态氮的浓度降低则菌株具有好氧反硝化功能，从而筛选出脱氮效果良好的异养硝化-好氧反硝化菌。

将目的菌株活化后稀释涂布至反硝化培养基, 观察菌落形态特征。使用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，16S rRNA基因的PCR扩增采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′进行，将获得的PCR产物送至华大基因进行测序，得到测序结果后在NCBI中进行Blast分析，通过MEGA X软件构建系统进化树。

1.4 菌株的异养硝化影响因素研究

研究菌株不同的异养硝化影响因素时，均将1 mL菌株接种到100 mL配置的培养基中，在摇床中培养72 h，每6 h取一次样测OD600，另外取2 mL样进行离心，检测上清液中的氨氮含量，其余各项试验条件如下(每个条件下设置3组平行试验)。

pH：配置pH分别为5、6、7、8、9的液体培养基，丁二酸钠为碳源，硫酸铵为氮源，C/N=10(质量比)。设置摇床为温度28℃，转速为170 r/min。

温度：设置摇床温度分别为15℃、25℃、35℃，转速为170 r/min。配置pH=7.0，丁二酸钠为碳源，硫酸铵为氮源，C/N=10的培养基。

碳源：配置碳源分别为葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、淀粉、碳酸氢钠，硫酸铵为氮源，C/N=10，pH=7.0的培养基。设置摇床为温度28℃，转速为170 r/min。

C/N：配置碳氮比分别是0、5、10、15、20、25、30，pH=7.0，丁二酸钠为碳源，硫酸铵为氮源的培养基。设置摇床为温度28℃，转速为170 r/min。

氨氮浓度：配置氨氮质量浓度分别是50 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L，pH=7.0，丁二酸钠为碳源，硫酸铵为氮源，C/N=10的培养基。设置摇床为温度28℃，转速为170 r/min。

1.5 菌株在异养硝化-好氧反硝化培养基中的脱氮特性研究

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

菌株L3在固体培养基上培养24 h后，菌落呈圆形、乳白色，且表面光滑。对菌株L3的16S rRNA基因进行PCR扩增，得到长度为1401 bp的序列。将菌株L3的16S rRNA基因序列经BLAST比对分析，发现菌株L3与假单胞菌同源性最高。利用MEGA X软件对菌株L3构筑系统发育树，结果如图1所示。菌株L3与假单胞菌在同一发育地位，确定菌株L3为假单胞菌。

图1 基于16S rRNA基因同源性构建菌株L3与相关好氧反硝化菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic trees of strain L3 based on partial 16S rRNA gene sequences with neighbor-joining analysis

2.2 pH对菌株生长和硝化性能的影响

pH影响细菌的生物活性，适宜的pH是细菌具有良好硝化特性的重要条件之一。由图2可知，菌株L3在pH为5～9这一范围内均能生长。当菌株培养30 h，相比于其他几种条件，pH=5时菌株的生长速度缓慢，菌株到达生长峰值所需时间更长，且氨氮的去除速率最慢，推测知酸性条件不利于该菌株的生长及氨氮的去除。pH为6～9时，氨氮的最大去除率达到88.5%～94.2%，但当菌株培养24 h，pH=9条件下氨氮的去除速率明显低于其他3种pH条件下的氨氮去除速率。所以，保证菌株L3生长以及良好硝化作用的最适pH为6～8，与方海洋等[18]研究中菌株Alcaligenes faecalis No.4所得结果相同。

图2 pH对菌株L3生长和硝化性能的影响Fig.2 Effect of pH on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.3 温度对菌株生长和硝化性能的影响

温度的改变可以通过影响蛋白质的合成、微生物的代谢以及基因调控等过程对微生物造成广泛的影响[19]。由图3可知，在菌株L3培养30 h时，15℃条件下菌株生长缓慢，方开始进入指数增长期，而25℃条件下菌株即将达到生长峰值，35℃条件下菌株已经达到生长峰值。此外，15℃条件下氨氮的最大去除率为72.0%，同样低于25℃时的97.1%和35℃时的97.7%，温度为15℃时不利于菌株L3生长及对氨氮的去除。因此，适合菌株L3生长的最适温度是25～35℃，与姜磊等[20]研究中YX-6菌所得适宜温度范围一致。

图3 温度对菌株L3生长和硝化性能的影响Fig.3 Effect of temperature on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.4 碳源对菌株生长和硝化性能的影响

碳源是菌株硝化过程中的电子供体，同时为菌株生命活动提供所需能量[21]。由图4可知，菌株L3在以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠为唯一碳源时均能生长，其中丁二酸钠作碳源时菌株L3的OD600最高，柠檬酸钠次之，但两者数值相近，以蔗糖、淀粉为唯一碳源时，OD600很小，推测是由于不同碳源有不同的分子结构，有机酸相较于糖类更易于被菌株利用[22]。以碳酸氢钠为唯一碳源时，菌株不生长。以丁二酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠为唯一碳源时，氨氮的去除率较高，最高去除率分别为96.1%、87.5%和74.7%。以葡萄糖、蔗糖、淀粉、碳酸氢钠为唯一碳源时，氨氮的去除率小于27.5%。由此推知，适宜菌株L3生长的最佳碳源是丁二酸钠，与王田野等[23]研究菌株SQ2得到的结果一致。

图4 碳源对菌株L3生长和硝化性能的影响Fig.4 Effect of carbon source on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.5 C/N对菌株生长和硝化性能的影响

由图5可知，C/N=0时，菌株L3不生长，C/N=5时，菌株L3生长量较低，且氨氮去除量较低，由于没有足够的能量供菌株生长，影响了菌株的异养硝化特性[24]。C/N为10～30时，氨氮的最大去除率达到88.8%～96.8%。培养72 h时，尽管C/N=30时菌株OD600最高，但是碳氮比过高时会造成资源浪费，当菌株培养6～18 h，C/N为10和15条件下，氨氮的去除速率明显高于其他碳氮比条件下的去除速率。综合考虑，菌株L3生长的适宜C/N为10～15。

图5 C/N对菌株L3生长和硝化性能的影响Fig.5 Effect of C/N on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.6 氨氮负荷对菌株生长和硝化性能的影响

相比自养菌，异养菌通常可以适应高浓度氨氮废水[25]。如图6所示，氨氮初始质量浓度为50 mg/L时，菌株OD600最低为1.1，在高氨氮浓度下，菌株L3均生长良好，说明菌株耐受氨氮负荷范围广泛。试验中因异养菌利用外部碳源，TOC浓度较初始浓度大幅降低。亚硝态氮几乎无积累，硝态氮与羟胺有少量积累。在50 mg/L、200 mg/L氨氮负荷下，氨氮最大去除率分别高达98.5%和93.9%，在500 mg/L、1 000 mg/L氨氮负荷下，氨氮去除率分别为51.9%和39.8%。尽管随着氨氮初始浓度的增高，氨氮去除率有所降低，但菌株L3生长并未受到影响，且高于颜薇芝等[22]研究中的菌株YN3的氨氮耐受范围，所以菌株L3有潜在的实际应用价值。

图6 氨氮负荷对菌株L3生长和硝化性能的影响Fig.6 Effect of ammonia nitrogen loading on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.7 菌株的异养硝化-好氧反硝化特性研究

为研究菌株的异养硝化-好氧反硝化特性，将菌株分别接种到含有硫酸铵亚硝酸钠以及含有硫酸铵硝酸钠的培养基中，结果见图7。在含有硫酸铵和亚硝酸钠的培养基中，0～30 h内，菌株一直处在迅速生长状态，OD600最大值为1.5，此时总氮、氨氮和亚硝态氮均处于迅速去除阶段，这3种物质最大去除率分别为88.3%、95.8%和95.4%。0～6 h，亚硝态氮含量不断增加，推测原因为菌株优先利用氨氮。在含有硫酸铵和硝酸钠的培养基中，OD600最大值为1.5，亚硝态氮有少量积累。硝态氮的去除速率在0～12 h较低，而后升高，推测是由于菌株优先进行硝化作用。总氮、氨氮和硝态氮的最大去除率分别是90.6%、93.9%、97.7%。由此推知，菌株L3在2种培养基中均能优先利用氨氮进行异养硝化作用，且都有良好的脱氮效果。

图7 菌株L3在同步硝化反硝化过程中的物质变化曲线Fig.7 Changing curves of substances during the process of bacterial simultaneous nitrification and denitrification

3 结 语

笔者从水产养殖生物絮团中分离出一株异养硝化-好氧反硝化细菌L3，通过对其进行形态学观察和16S rRNA基因序列分析，确定此菌株为假单胞菌。通过对不同影响因素下菌株的异养硝化能力进行研究，得到适宜菌株生长的最佳pH为6～8，最适宜温度是25～35℃，最佳碳源是丁二酸钠，最佳碳氮比为10～15，菌株能耐受高浓度氨氮负荷。对菌株脱氮性能的研究表明，在异养硝化-好氧反硝化培养基中，菌株优先利用氨氮进行异养硝化反应且有良好的脱氮效果。因此，从水产养殖生物絮团中分离得到的具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌株L3有运用到未来实际生产工作的巨大潜力。