我国君子兰组织培养的研究进展

罗俊霞,赵建波,王 俊

(1.郑州市农产品质量检测流通中心,河南 郑州 450006;2.郑州市农业技术推广中心,河南 郑州 450008;3.郑州市农林科学研究所,河南 郑州 450000)

君子兰为石蒜科君子兰属多年生草本植物，中国普遍栽培的君子兰(Clivia viaminiata)属于君子兰属中大花君子兰类和垂笑君子兰类[1～2]。大花君子兰和垂笑君子兰原产于南非，于20世纪初经德国和日本引入我国[2～3]。君子兰的有性繁殖后代为高度杂合型，亲本的优良性状不能通过杂交得到稳定保存[4]，用种子繁殖，实生苗容易产生变异且种苗生长缓慢、植株后代分离严重，很难保持母株的优良性状[4～5]；因此，在生产中，君子兰一般采用分株法进行繁殖，但是因母株萌芽少，特别是优良品种产生的小芽更少，因此君子兰繁殖速度慢，繁殖量少。为了探索出君子兰快速繁殖的有效途径，我国的广大科技工作者在君子兰的组织培养方面做了大量的有效的尝试。据有文献资料记载，我国的君子兰组织培养的研究开始于20世纪80年代初期[2,7]。目前，我国君子兰在组织培养和快速繁殖技术方面的研究已经小有成就，因组织培养建立起来的快速繁殖技术在生产上得到较为广泛的应用。

1 外植体

1.1 外植体的选择

外植体是植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。植物营养器官和生殖器官均可以作为外植体进行组织培养。在我国君子兰组织培养的研究中，早期以花蕾期的花丝、花药、花瓣、花柄、花柱、花托、子房、子房壁居多[2,5,7]，后来逐渐发展到用种子的胚、叶、茎、根、果实、果柄等作为组织培养的外植体[2,6,8～13]。

1.2 各种外植体在组织培养的效果

1.2.1 生殖器官作为组织培养外植体的培养效果 采用君子兰的种子各部位为外植体进行组织培养获得了不同的研究结论[2,6,9]，采用君子兰的种子为外植体进行组织培养较其他外植体有利于诱导愈伤组织，“胜利”和“和尚”的种子离体培养过程中会直接形成丛生芽，增殖率较高[2]，出愈率的高低和君子兰的基因型有一定的关系[2]；君子兰成熟胚在组织培养中能产生分蘖株[6]，而胚分化指数大于0.7的成熟胚在脱分化培养基上很难形成愈伤组织，并在激素的作用下形成畸形真叶，在不加任何激素的MS培养基上很快长成可以分蘖的小苗[6]；采用授粉后108 d的种子进行播种，不能成苗，但用同龄幼胚培养则获得了较高的发芽率，提早成苗的效果显著[9]，利用两个品种的君子兰的幼胚进行组织培养，两个不同的品种获得出愈率差异显著，且均较低[12]，造成幼胚出愈率差异的原因可能和品种有关系；另有些学者认为君子兰的组织培养以种子为外植体会出现广泛的变异，优良性状消失[13～14]。

不同学者采用花器官的不同部位作为外植体进行组织培养获得了不同培养效果[3,5，7，14～24]。以花丝、花被筒、子房壁、胎座、胚珠、花柱为外植体进行组织培养后均产生了愈伤组织，但用花药、花瓣、花柄、花葶作外植体未能产生愈伤组织[3]；子房、花丝、花托在不同的培养基上进行培养后有不同程度的愈伤组织产生[5]；以君子兰的花丝、花瓣、子房壁和胚珠在选用的不同的培养基上培养一个月后，相继出现愈伤组织[7]，但用君子兰的花药为外植体进行多次培养，未能诱导出愈伤组织[7]；花丝外植体的诱导与分化能力与花蕾发育时期有关，花蕾长度为0.6～1.0 cm时，花丝的出愈率最高，在0.1～0.5 cm之间时，花丝的出愈率较低，当花蕾长度大于1 cm时，花丝外植体全部褐化死亡[14]；在花丝离体培养中有类似体细胞胚的结构产生[14～15]；取自同一花蕾的子房断块，培养在含有相同激素成份的培养基中，出愈率可以达到80%～90%[15]；君子兰幼嫩子房进行诱导并筛选出0.2～1mm颗粒状组成的及瘤状结构的胚性愈伤组织后，用无菌解剖刀切割成单细胞，可以在诱导培养基上长期浅层继代培养[16]；君子兰幼花序子房在MS进行诱导出愈率达到70%～80%，可以用分割愈伤组织块的办法在MS培养基上进行继代培养[17]；分别以完整子房、胚珠+胎座、胚珠及对未授粉的子房进行横切后进行接种，在不同的培养基上经过不同的时间获得不同的出愈率及不同的愈伤形态，但是以胚珠连同胎座一起接种的方式出愈率最高，以胚珠为外植体进行接种处理的出愈的时间较长[18]；在相同的条件下，不同品系的君子兰幼子房进行组织培养出愈率和分化率均存在较大差异，采用绿色花苞期的幼子房做外植体进行组织培养效果最好[19]；君子兰花器官离体培养过程中愈伤组织的诱导与分化均十分缓慢，在花瓣、花丝、胚珠3种外植体中，其出愈率和分化能力均不相同，花瓣外植体的出愈率和分化率最高[20]，花瓣外植体的诱导与分化与花蕾的大小有关系，花蕾长度为0.6～1.0 cm时，花瓣的愈伤组织的出愈率和分化率最高，分别为15.6%、57.1%，其他长度的花瓣外植体则基本褐化死亡[20]；在顶芽、腋芽、茎、茎尖、子房壁、嫩叶、花柱、花丝、花瓣、花柄、胚珠、胎座等13种外植体中以子房壁的出愈率和繁华率为最高[21]。

以君子兰果实器官为外植体进行组织培养的研究比较少，2011年袁丽伟等学者分别用“胜利”和“和尚”两个品种的已经成熟果实的子房壁和果柄为外植体进行组织培养，结果以已经成熟果实的子房壁为外植体分别获得了40%、15%的出愈率，以果柄为外植体进行组织培养没有获得愈伤组织[12]；出愈率和君子兰的基因型有关系[12]。

1.2.2 营养器官作为组织培养外植体的培养效果 根、茎、叶器官的分生组织是组织培养中的常用外植体，早在20世纪80年代就有人利用君子兰的茎尖、幼茎、茎切段为外植体进行组织培养成功获得了愈伤组织[3，8]；2000年，刘福平等学者用茎尖纵切块、茎切块为外植体进行组织培养诱导出了愈伤组织[10]；但利用君子兰的茎切段为外植体的组织培养中，对茎采用不同的切法进行比较，采用纵切两刀和纵切两刀并横切一刀的茎上部这两种外植体诱导出了芽和根[8]；但取茎尖做外植体对君子兰母体伤害较大[13]；因为君子兰的茎为短缩茎，在组织培养过程中取材难度大，且难以进行消毒，接种后褐化严重[2-3]，不宜作外植体[3，13]，但夏万由认为采用君子兰茎尖作为外植体可以去除病毒，解决因长期无性繁殖导致病毒积累而引起的君子兰品质下降的问题[22]。

以君子兰叶片为外植体进行组织培养，王永明等成功的获得了愈伤组织[3，13，22-23]；刘福平用幼叶基部横切段和幼叶为外植体也诱导产生了愈伤组织[10]，赵妮在君子兰前期叶片组织培养中虽然诱导产生了少量的愈伤组织，但后期未能继续分化[11]；李淑华和刘敏分别用叶片和君子兰幼叶作为外植体进行组织培养，没有发现愈伤组织产生[5,7]。

以君子兰根器官为外植体进行组织培养的研究较少[3,7,10]，未见较为详细的报道。王永明以幼根为外植体进行培养研究，发现幼根的愈伤组织初期呈淡黄色或淡褐色，数月后转成淡绿色致密的块状物[3]；刘敏、刘福平分别用君子兰的肉质根和根切段为外植体进行组织培养均未能诱导产生愈伤组织[7,10]。

外植体的选择与处理在其组织培养中有重要作用，但整体来讲，为了保证组织培养的成功，无论是何种外植体都需要取其生理年龄较幼的器官及部位[22]；因为幼年的组织较老年的组织有较强的形态发生能力。

1.3 外植体的消毒方法和取用方法的筛选

在以种子为外植体的组织培养中，种子直接采自果实的种子，用70%的酒精10s+0.1%升汞8 min进行消毒是最佳的种子消毒方法[2]；在果实、果柄、幼胚为外植体的组织培养中，外植体用70%的酒精3 min+无菌水冲洗3次+0.1%升汞3 min+无菌水冲洗3～5次均获得了较低的污染率[12]；在以花器官(花瓣)为外植体的组织培养中，用0.1%升汞10 min消毒对降低花器官(花瓣)接种污染有一定的效果[20]。

2 培养基的选择及植物生长调节剂的配比

各文献在君子兰组织培养中所使用的植物生长调节剂配比及培养效果。

2.1 基本培养基

基本培养基是君子兰外植体离体生长、发育的重要营养源，主要由基本培养基和植物生长调节剂组成[4]。君子兰组织培养的培养基均是在基本培养基的基础上添加有机物、植物生长调节剂、其他营养物质而形成的，目前用于君子兰组织培养试验的基本培养基有MS、N6、B5、Miller、White、ER、SH、农试培养基等，其中用基本培养基MS进行君子兰组织培养尝试的且成功的较多[2～3，20]，以MS、N6、B5为基本培养基添加相同比例植物生长调节剂成份进行幼嫩子房段块的组织培养时以MS基本培养基的出愈率最高，大于90%，N6、B5基本培养基的出愈率在80%～90%之间，但后者不能诱导出胚性愈伤组织，而在MS添加相同比例植物生长调节剂的培养基中可以诱导产生胚性愈伤组织[15]；在MS、B5、White、ER、SH5种基本培养基中，只有MS和SH培养基可以获得不定芽，B5和ER不适应于君子兰的组织培养，White在诱导方面作用不明显，但有益于壮苗和生根，诱导以MS为最好[24]。

2.2 植物生长调节剂在君子兰组织培养愈伤组织的诱导和愈伤组织分化中的应用

由表1可知，在各学者在君子兰的组织培养中采用了不同的外植体，对相同外植体采用了不同的取用方法，同时由于每一个试验中所采用的培养条件稍有差别、所使用的外植体的母株的生长势千差万别，所以即使使用相同的外植体进行组织培养各学者在基本培养基中所添加的植物生长调节剂或者其比例也稍有差别，但在组织培养时添加6-BA、NAA、2,4-D植物生长调节剂的居多，另有在6-BA、NAA、2,4-D 基础上添加一定比例的ZT、KT、IBA、IAA、LH的，不同的植物生长调节剂的配比经过不同组织培养时间后取得了不同的培养效果；获得的愈伤组织经过相同或者不同的培养基进一步诱导有些愈伤组织可以分化成苗，如幼嫩子房既可以在MS+KT2.0+2,4-D1.0+3%蔗糖培养基上、茎尖、茎切块、叶基部切段在MS+6-BA2.0+NAA2.0+2,4-D1.0培养基上、叶中上部的横切段在MS+6-BA5.0+NAA0.5+2,4-D1.0上既诱导出愈伤组织，其愈伤组织也可以在同样的培养基上分化成苗[10,13-15，20]，只是相同的外植体在同一种培养基上的出愈率和所产生的愈伤组织的分化率有差别，也就是说改变植物生长调节剂的种类和比例可以改变组织培养愈伤组织的出愈率或者分化率；也有研究报道愈伤组织的诱导培养基和分化培养基不相同，也就是愈伤组织的诱导培养基只能诱导愈伤组织的产生、分化培养基只能诱导愈伤组织分化成苗，如用幼子房为外植体进行愈伤组织诱导的最佳培养基是MS+6-BA1.0+NAA1.0+2,4-D2.0+35 g·L-1蔗糖+酸水解酪素0.4 g·L-1，其愈伤组织分化成苗的最佳培养基是MS+NAA0.5+KT3.0+35 g·L-1蔗糖[19]；花丝、花被筒、子房壁、胎座、胚珠、花柱、幼根、茎尖、幼茎、胚在MS+6-BA0—1+NAA0—5+2,4-D0-3+30-80 g·L-1蔗糖培养基上可以产生愈伤组织，但愈伤组织不能分化，胚、幼茎、幼叶、茎尖、幼根的愈伤组织在MS+6-BA0.1+NAA0.05+2,4-D0.5-2+25-40 g·L-1蔗糖培养基上可以分化成苗[3]。

表1 各文献中推荐的最佳君子兰组织培养中所使用的植物生长调节剂配比及培养效果

2.3 君子兰组织培养中的生根培养基

君子兰组织培养中的生根培养基见表2。

表2 各文献中君子兰组织培养中的生根培养基及培养效果

由表2知，君子兰组织培养的生根培养基均是以MS为基础培养基添加适量的植物生长调节剂、蔗糖、琼脂粉及活性炭形成的，1/2MS无机盐+MS有机物+6-BA0.5+IBA0.2+IAA0.6和MS+IAA0.2+NAA0.4+KT0.1之间前者比后者生根率高，但两者较单用MS不加任何植物激素的培养基优[5]；王力超用植物生长调节剂将幼胚处理后接种在IBA0.1、IBA0.5+活性炭3g·L-1、IBA1.0+活性炭3 g·L-1等三种培养基上，幼胚的发芽率升高，因此在生根培养基中加入1.0 mg·L-1的KT和0.5 mg·L-1的NAA对幼胚发芽最有利[9]；将愈伤组织接种在1/2MS+NAA0.2+KT0.1+2%蔗糖和1/2MS+IBA1.0+BA0.2+2%蔗糖两种生根培养基中，其生根速度相同[10]；在生根壮苗培养基中可以加适量的活性炭促进生根[9；16]；诱导产生的丛生芽一部分可以在分化培养基中生根，不能在分化培养基中生根的转入生根培养基中2个月后多数生根，在1/2MS+20或35g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉和1/2MS+NAA0.25或0.5+KT0.25或0.5+20g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉两种生根壮苗培养基中，其生根率大致相当，改变蔗糖、NAA及KT的浓度，对其生根率的改变不大，其生根率在76.4%～100%之间[19]；细胞分裂素与生长素的比值低时有利于生根，MS+6-BA1.0+ NAA0.1+4%蔗糖+0.4%琼脂为适宜的生根培养基[22]。

2.4 其他物质在君子兰组织培养中的应用及其对组织培养效果的影响

由表1和表2可知，在君子兰的组织培养中不仅引入了植物生长调节剂，还引入了琼脂、蔗糖、活性炭、水解蛋白乳、酸水解酪素等其他成份。琼脂是选用优质天然石花菜、江蓠菜、紫菜等海藻为原料，采用科学方法精炼提纯的天然高分子多糖物质，它和蔗糖的添加主要是给培养基中注入了更多的能量和有机物，诱导愈伤组织的培养基中适宜的蔗糖浓度是3%[20]，但在生根培养基中加入相同浓度的蔗糖，不同品系的君子兰子房外植体愈伤组织的生根率稍有差别[19]；活性炭的加入对君子兰叶片和花丝外植体的诱导和分化产生很大的影响，不利于外植体的分化[13～14]，但活性炭适合添加在君子兰的生根培养基中[9,16]；水解蛋白乳和酸水解酪素是多种氨基酸的混合物，它们的添加可以提供君子兰组织培养全面的营养元素，但容易引起污染[4]；随着酸水解酪素质量浓度的增加，外植体的出愈率有所升高，达到400mg·L-1时出愈率最高，当其质量浓度达到600mg·L-1时出愈率转为降低同时大部分愈伤组织呈现玻璃化状态[19]。

3 君子兰组织培养中其它因素对其效果的影响

3.1 在君子兰组织培养过程中进行低温处理对培养效果的影响

在4℃的条件下对花丝、叶片、子房进行低温预处理，随着预处理天数的增加，外植体的出愈率和分化率均减低，未经过预处理的外植体的出愈率和分化率均为最高，低温预处理的天数分别和出愈率、分化率呈反相关[13～14；19]；同时，随着预处理天数的增加，外植体的污染率升高，低温预处理的天数和污染率呈正相关[19]。

3.2 暗培养对君子兰组织培养效果的影响

在组织培养的过程中，将接种后的外植体进行暗培养，随着暗培养的天数的增加，外植体的出愈率和分化率均减低，未经过暗培养的外植体的出愈率和分化率均为最高，暗培养的天数和出愈率、分化率呈负相关[13～14]。

3.3 组织培养过程中的光照强度对组织培养效果的影响

在500～2 000 lx范围内，随着光照强度的增加，外植体的出愈率呈现上升的趋势，光照强度同出愈率呈负相关。就子房外植体的出愈率来讲，最佳的光照强度是2 000 lx[19]。

4 存在的问题

君子兰的组织培养中褐变是阻断培养的一大阻碍[11]，在组织培养过程中不良的培养条件也会导致出现褐化、老化、玻璃化的现象[12,14,19]，因此，在君子兰的组织培养过程中应该尽可能的延长培养时间[12]，改变培养条件，调整培养基中植物生长调节剂的比例来防止褐变的发生[11-12,14,19]，提高君子兰组织培养的出愈率和分化成苗的能力。另外，君子兰外植体生长分化缓慢，也是君子兰组织培养应用于商业化生产中的制约因素，在君子兰经过组织培养成苗的过程中有些可以一次成苗，大部分要经历两个步骤：一是诱导产生胚性愈伤组织，二是胚性愈伤组织先形成芽，然后芽伸长后在其基部长出根形成小植株[15]，因此，在生产中利用有限的材料获取尽可能多的外植体材料并促进其愈伤组织有效分化才能提高君子兰组织培养的效率，扩大君子兰组织培养在其商业生产中的应用。