嵌合抗原受体自然杀伤细胞在血液系统恶性肿瘤中的研究进展

崔蕊 邓琦

天津市第一中心医院血液科300192

0 引 言

作为固有免疫系统的重要成员，自然杀伤（natural killer，NK）细胞是机体抗击病毒感染及肿瘤的第一道防线。过去15年中，尽管诸多临床试验结果已证实供体NK 细胞治疗肿瘤的安全性及可行性，但因肿瘤细胞可通过免疫逃逸机制逃避NK 细胞攻击而限制了NK 细胞的临床应用。鉴于嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell,CART） 在急性B 淋巴细胞白血病（B cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）及B 细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma, B-NHL）中的显著疗效，2017年美国食品药品监督管理局及欧盟批准两种CAR-T 细胞产品用于治疗B-ALL 和BNHL，使CAR-T 细胞免疫治疗成为当今血液肿瘤治疗的前沿。嵌合抗原受体自然杀伤细胞（chimeric antigen receptor natural killer cell, CAR-NK）可通过反转录病毒及慢病毒转染表达胞外抗原识别区[单链抗体可变区（single-chain variable fragment, scFv）]而克服其免疫逃逸缺陷。相较于CAR-T 疗法，CARNK 细胞作为效应细胞具有诸多优良特性。例如CAR-NK 细胞的毒副作用较CAR-T 低，可大大降低CAR-T 治疗毒性所致的昂贵住院费用。此外，制作CAR-NK 现货型（off-the-shelf）产品可缩短生物制品的制作周期，并克服血液肿瘤患者因自身T 细胞功能缺陷而影响CAR-T 细胞扩增[1]。本文对CAR-NK载体构建、在血液肿瘤中的临床初步应用及面临的挑战进行综述。

1 CAR-NK 免疫治疗机制

CAR-T 细胞治疗是一项基因工程技术，其机制为使正常T 细胞表面表达能识别肿瘤抗原的受体，通过将抗体对肿瘤抗原的高亲和性和T 淋巴细胞的杀伤功能相结合，使T 细胞能识别并特异性杀伤肿瘤细胞[2-3]。CAR 是靶向目标表面分子的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合域、跨膜区和胞内信号区3 个部分，针对每个区域的不同设计会影响CAR-T 细胞的功能。胞外区源于scFv，由轻链和重链共同组成，负责抗原的识别。目前已设计出的scFv 可识别抗原包括CD19、CD20、CD22、CD33 等。跨膜区连接胞内区和胞外区，一般由二聚体膜蛋白组成，将CAR 结构锚定于T 细胞膜上。跨膜区的不同设计影响导入的CAR 基因的表达能力。此外，胞内信号区结构域决定着活化信号的强弱，直接影响杀伤效果。第一代CAR-T 使用CD3ζ 作为细胞信号结构域，第二代CAR-T 采用CD3ζ 联合CD28 或4-1BB，第三代CAR-T 采用CD3ζ 联合CD28 和4-1BB胞内信号结构域，第四代的CAR 结构则加入了细胞因子或共刺激配体，从而使改造过的效应细胞的扩增活性和寿命有所提升[4]。

目前多数CAR-NK 胞内结构域源自T 细胞的CAR 结构，其中Chu 等[5]设计的针对多发性骨髓瘤细胞系及原代细胞的CAR-NK 结构采用二代CART 胞内结构域。亦有研究采用CD3ζ 联合CD28 和4-1BB 胞内信号结构域作为CAR-NK 胞内结构域[6]。CD28/CD3ζ 共刺激信号虽对NK 细胞同样有效，但因NK 细胞胞内信号结构域与T 细胞存在显著差异，NK 细胞特异CAR 结构中胞内信号段仍需改进优化。近期研究设计的针对NK 细胞特异活化受体2B4 联合CD3ζ 以及采用DAP10、DAP12 信号作为胞内结构域，均体现出更强的诱导NK 细胞活化的特性。其中，Xu 等[7]设计了针对CD5+CAR NK-92 细胞，该结构采用NK 特异活化受体2B4 与CD3ζ 联用的胞内信号结构域，较4-1BB 与CD3ζ 胞内信号结构域对CD5+的慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphoblastic leukemia,CLL）及T 淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤原代细胞均具有更强的细胞杀伤效应，且该胞内信号结构域在动物体内同样具有较强的细胞杀伤作用。此外，Toepfer 等[8]研究发现DAP12作为胞内信号结构域与CD3ζ 同样具有较强的激活下游信号的能力。以NKG2D 作为胞外域的CAR结构可与多种肿瘤表面配体结合，Chang 等[9]利用NKG2D-DAP10-CD3ζ 构建的NK 细胞活化受体对于ALL 及前列腺癌等肿瘤拥有较强的抗肿瘤活性。因此利用NK 细胞自身相关激活元件设计的胞内信号结构域能较好地在体内诱导、活化NK 细胞。

2 NK 细胞来源

2.1 NK-92 细胞系

NK-92 细胞系的表型为CD56bright/CD16neg/low，低表达CD3、CD8，高表达活化受体NKG2D、天然细胞毒受体NKp30 和NKp46 以及一系列与细胞毒有关的分子如穿孔素和颗粒酶B[10]。NK-92 是广泛应用的NK 细胞系，与原代NK 细胞相比缺乏杀伤细胞免疫球蛋白样受体，一直处于活化状态。NK-92 细胞系因缺乏或低表达CD16 而不能通过抗体依赖的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）效应杀伤肿瘤细胞，使得NK-92 细胞系与原代NK 细胞有很大不同。有研究人员在NK-92 细胞系上过表达CD16 受体结合抗肿瘤单克隆抗体，以增强通过ADCC 达到清除肿瘤的效果[11]。众多研究结果显示，表达CAR 结构的NK-92 细胞系较未改造的NK-92 在抗原暴露后会释放更多的γ-干扰素[7]。此外，NK-92 基础细胞系的CAR 产品具有无限扩增的能力，可有效避免反复冻存对细胞的损伤，这使NK-92 细胞系有可能成为现货型细胞产品。然而，NK-92 细胞系EBV 病毒阳性且源自NK 细胞淋巴瘤，携带多种致畸基因突变，因此输注前需要照射。NK-92 辐照后可保留细胞毒性，但体内增殖能力较弱，输注后7 d 即被清除，因此以NK-92 为基础的CAR-NK 治疗需反复多次输注NK-92[12-13]。

2.2 脐带血来源的NK 细胞

静息状态的脐带血来源的NK 细胞较外周血来源的NK 细胞表型及功能更为原始，细胞增殖能力较强且对细胞因子的刺激较敏感。脐带血来源的NK 细胞高表达抑制性受体NKG2A，低表达激活性受体如NKp46、NKG2C 和DNAM-l 等[14]。在来自MD Anderson 的一项Ⅰ/Ⅱa 临床试验中，采用脐带血来源的NK 细胞表达抗CD19 CAR，过表达增强NK细胞活性的白细胞介素-15（interleukin-15,IL-15）及可诱导的自杀基因iCas9，用于治疗复发难治的CLL、ALL 及NHL，临床试验结果提示总体治疗效果显著且无明显毒副作用[15]。

2.3 外周血来源的NK 细胞

相比于脐带血来源的NK 细胞，外周血来源的NK 细胞更加成熟，增殖能力减弱而功能性更强[16]。外周血来源的NK 细胞作为过继细胞治疗的安全性已被多项临床试验结果证实，其中有自体或异体NK 细胞来源的，亦有人类白细胞抗原相合或不相合NK 细胞，杀伤细胞免疫球蛋白样受体配体匹配或不匹配的供者NK 细胞被用于临床试验[17-20]。外周血来源的NK 细胞通常采自正常健康供者外周血有核细胞，去除CD3 和CD19 后通过细胞因子IL-2 及IL-1 体外扩增进而输注入患者体内。NK 细胞的扩增方式主要有两种：细胞因子为基础的体外扩增及滋养层细胞为基础的扩增。

2.4 诱导多能干细胞来源的NK 细胞

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）来源的NK 细胞同时拥有外周血来源的NK细胞和NK 细胞系的优点，不仅性质均一，可通过单细胞转染而大量扩增，还无需辐照即可注入体内。与NK-92 细胞一样，iPSC 低表达CD16 且高表达NKG2A，过表达CD16 受体结合抗肿瘤单克隆抗体，发挥ADCC 作用达到清除肿瘤的效果[21]。目前仅在卵巢癌的移植鼠模型中证实iPSC 来源的NK 细胞过 表 达NKG2D、2B4 及CD3ζ 信 号 域（NK-CARiPSC-NK），与外周血来源的NK 细胞及利用T 细胞CAR 结构域的iPSC 来源的NK 细胞（T-CAR-iPSCNK）相比，利用NK 细胞特异性信号结构域的NKCAR-iPSC-NK 抑制肿瘤细胞生长及延长小鼠生存能力显著增强[22]。

3 CAR-NK 细胞与CAR-T 细胞治疗比较

目前国际上注册的有关CAR-T 临床试验达200 余项，CAR-T 对血液肿瘤治疗的优势在于：①特异性抗原识别及主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）分子非依赖性。与传统T 细胞相比，CAR-T 细胞可利用该新型受体特异性攻击表达特定抗原的肿瘤细胞，且这种免疫识别无需MHC分子的介导[23]。该特性可在一定程度上弥补传统免疫治疗无法识别不表达MHC 的肿瘤细胞的短板。②抗原识别种类广泛。CAR-T 细胞可识别各种类型的潜在抗原，包括脂类、蛋白类、碳水化合物类抗原，且可联合特异性抗体共同识别不同类型抗原[24]。然而，CAR-T 细胞治疗存在毒副作用较大、制备费用昂贵、制作周期较长、复发后再次输注疗效欠佳、在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）及CLL 患者体内扩增受限等问题，限制了其在其他血液肿瘤中的广泛应用。CAR-NK 细胞的主要优势体现在：①多种机制有效抗肿瘤杀伤效应。CAR-NK 细胞可通过CAR 依赖性和NK 细胞受体依赖性机制杀死靶细胞，以消除肿瘤相关抗原阳性的肿瘤细胞或表达NK 细胞受体配体的肿瘤细胞。既往的研究结果发现，AML 患者异基因造血干细胞移植后通过移植物抗肿瘤效应达到抗肿瘤作用，因肿瘤抗原表位MHC-Ⅰ分子表达丢失导致CAR-T细胞不能识别肿瘤细胞[17,25]。CAR-NK 细胞无自身抗原表达，执行杀伤功能时无需被激活，且无限制性，因此可识别MHC-Ⅰ阴性的肿瘤细胞而保留自身的天然杀伤作用[26]。肿瘤干细胞低表达MHC-Ⅰ分子，同时表达激活性受体NKp30、NKp44 和NKG2D配体，这些配体的表达可进一步增强肿瘤干细胞对细胞因子介导的NK 细胞杀伤作用的敏感性。②安全性及操作简易。同种异体的NK 细胞临床应用较为安全，无引起移植物抗宿主病（graft versus host disease,GVHD）的风险[27]。目前CAR-T 细胞治疗的主要相关毒副作用如细胞因子综合释放征（cytokine release syndrome,CRS）和神经毒性是导致患者病死率增加及治疗费用昂贵的重要因素。CAR-NK 细胞可作为现货型产品生产，制作周期较短，临床试验及临床前期试验结果均提示其治疗后的毒副作用较小[4]。

4 CAR-NK 临床前研究及临床转化研究

4.1 AML

一项Ⅰ期临床试验结果显示，外周血来源的记忆性NK 细胞在AML 患者体内扩增良好，对AML细胞系及AML 原代细胞具有较强的细胞毒效应[28]。9例患者中5例有治疗反应，其中4例达到完全缓解。因此，细胞因子诱导的记忆性NK 细胞未来有望成为复发难治AML 的有效免疫治疗方法[28]。CD33在正常及肿瘤干细胞表面均有表达，Tang 等[29]设计出抗CD33 的CAR-NK-92 细胞用以治疗1例14 岁AML-ETO(+)复发难治AML-M4 患者，该患者为异基因造血干细胞移植后15 个月复发。患者于接受预处理后第1、3、5 天分别输注抗CD33 的CAR-NK-92细胞（输注剂量分别为3×108、6×108、1×109个）。输注后第2 天患者体温升至38.5 ℃；输注后第6 天细胞因子IL-6 及IL-10 水平显著升高，但48 h 后很快降至正常；输注后肿瘤坏死因子-α、IL-2、IL-4 及IL-17A 等水平无显著变化，CRS分级1 级，输注后1 个月骨髓涂片结果提示原始细胞比例降至0%[29]。

4.2 淋巴瘤及白血病

目前CAR-NK 细胞用于B/T 细胞淋巴瘤、B 细胞来源的白血病及多发性骨髓瘤的临床前研究结果见表1。

Romanski 等[36]发现NK-92-CD19-CD3ζ 结构对NK 细胞耐受的CD19 阳性白血病细胞系及原代白血病细胞的杀伤作用显著增强。Shimasaki 等[37]将CD19-4-1BB mRNA 电转入NK 细胞，体内及体外实验结果证实了CAR-NK 细胞的杀伤作用，且回输CAR-NK 后小鼠白血病肿瘤负荷明显下降。除CD19靶点外，Chu 等[32]将CD20 CAR mRNA 电转入外周血来源的NK 细胞后发现，Raji 细胞移植的NSG 小鼠模型肿瘤细胞生长得到抑制，小鼠生存期延长，提示CD20 CAR-NK 细胞对CD20 阳性Burkitt 淋巴瘤具有抗肿瘤效应。该研究团队还发现罗米地辛单独或联合CAR-NK 细胞对Burkitt 淋巴瘤也具有抗肿瘤效应[33]。在CLL 原代细胞的体外实验中，抗CD20 CAR-NK-92 细胞较美罗华及奥法木单抗具有更强的抗肿瘤效应[12]。但迄今尚无抗CD20 CAR-NK的临床转化研究数据报道。

目前仅有少数来自临床转化研究的结果。其中MD Anderson 的一项Ⅰ/Ⅱa 期试验（NCT03056339）将CD19 CAR-NK 细胞用于治疗淋巴瘤取得了振奋人心的临床试验结果[15]。该试验中脐带血来源的NK细胞体外持续表达IL-15 及iCas9 自杀基因，共有11例复发或难治性CD19 阳性肿瘤患者接受治疗，包括5例CLL 和6例NHL。中位随访13.8 个月（2.8～20 个月），有8例（73%）患者获得治疗反应，其中7例（64%，4例NHL 和3例CLL）病情达到完全缓解。接受抗CD19 CAR-NK 治疗患者未发生CRS、神经毒性和GVHD，炎症细胞因子IL-6 水平较基线无显著增加，且此次临床试验中CD19 CAR-NK 细胞未达到最大耐受剂量。除B 细胞淋巴瘤及白血病外，抗CD5 CAR-NK-92 细胞在体外对CD5 阳性细胞系和原代细胞均具有较强的抗肿瘤活性[35,38]，抗CD3 CAR-NK-92 细胞在体外对T 细胞淋巴瘤及白血病细胞系也具有较强的细胞杀伤效应[39]。因此，CARNK 细胞在T 细胞淋巴瘤及白血病治疗领域拥有较广阔的研究前景及临床价值。

4.3 多发性骨髓瘤

CS1 又被称作信号淋巴细胞激活分子家族成员7（signaling lymphocytic activation molecule 7，SLAM7）。多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）细胞高表达CS1，而正常免疫细胞包括NK 细胞、T 细胞的某些亚群和正常B 细胞均低表达CS1，骨髓细胞几乎不表达CS1[40]。因此，研究者构建抗CS1 的CAR 结构并表达于CAR-NK-92 细胞系。CS1-CAR-NK-92 细胞对原代MM 细胞具有较强的抗肿瘤活性，此外，给予NSG 免疫缺陷鼠模型尾静脉注射CS1-CARNK 细胞可有效控制肿瘤细胞生长并延缓小鼠的生存期。CD138 作为MM 的基本诊断指标，与肿瘤生长和MM 疾病进展密切相关[5]。Jiang 等[34]构建了抗CD138 的NK-92MI 细胞系，发现CAR-NK-92MI 对CD138 阳性的MM 细胞系及原代细胞的抗肿瘤效应较对照组显著增强，CAR-NK-92MI 在NOD-SCID小鼠模型中的杀伤作用也较对照组显著增强，杀伤肿瘤过程中会释放更多的颗粒霉素B、γ-干扰素且CD107a 脱颗粒活性增强。除上述CS1 和CD138 靶点外，抗CD38、BCMA、CD269 等也是CAR-NK 细胞可能的特异性治疗靶点，但目前尚无相关临床试验结果公布。

5 CAR-NK 技术发展面临的挑战

5.1 转染效率

目前CAR 基因转染的两大系统主要是无病毒的转座子基因转染系统和基于慢病毒、反转录病毒的转染体系。原代NK 细胞利用病毒转染体系的效率仅约15%，且反转录病毒转染可能会引起插入突变[41]，外周血来源的NK 细胞采用慢病毒转染效率亦很低。研究结果显示，将CAR 的mRNA 电转入原代NK 细胞，24 h 后转染效率可达82%[42]。无病毒的转座子转染技术可克服上述问题，被认为是目前较为安全的转染方式，也是未来发展的一个重要研究方向。

5.2 NK 细胞体外扩增、纯化及冻存

表1 CAR-NK 免疫治疗血液肿瘤的临床前研究结果

NK 细胞体外扩增体系是NK 细胞临床应用的一个主要瓶颈。目前，NK 细胞体外扩增体系主要有饲养细胞和无饲养细胞两种。基于饲养细胞的扩增体系所得NK 细胞纯度高、数量多，但因饲养细胞多为K562 等基因修饰的肿瘤细胞，其临床应用仍有潜在风险顾虑；无饲养细胞扩增体系可获得满足临床需要的细胞数量和纯度的NK 细胞，但个体差异较大，工艺稳定性仍有待提高。纯化外周血来源的NK 细胞是临床应用的前提。外周血来源的异体NK细胞可能掺杂T 细胞而引起GVHD 或淋巴细胞增殖性疾病。调节T 细胞及髓系抑制性细胞也会输入患者体内，从而抑制NK 细胞的活性[43]。合理冻存NK 细胞是CAR-NK 细胞成为即用型产品的前提。NK 细胞对于冻融异常敏感，NK 细胞的活性及细胞毒性在复苏后会大大降低[44]。文献报道，冻存NK 细胞的活性可通过添加IL-2 得以部分恢复[45]。

6 结 语

基于NK 细胞MHC 非限制性、泛特异性识别和杀伤靶细胞及快速应答的特点，CAR-NK 细胞在血液肿瘤免疫治疗的应用方面被寄予越来越多的关注和期待。但因其仅占外周血淋巴细胞的15%左右、体外扩增培养技术仍不成熟、DNA 转染效率低等技术瓶颈，临床应用方案等研究仍远远落后于T 细胞。新近的临床研究及临床前研究结果均提示CAR-NK 细胞对于AML、淋巴瘤、MM 等恶性血液肿瘤具有较强的抗肿瘤效应且不良反应较小，未来作为细胞免疫治疗拥有良好的前景及研究价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突