桥联黄素再生NAD+耦联L-谷氨酸脱氢酶高效产α-酮戊二酸

谭卓涛，付静雯，张肖旺，韩耀颖，付亚萍，朱晨杰，应汉杰

(南京工业大学 生物与制药工程学院 国家生化工程技术研究中心，江苏 南京 211800)

α-酮戊二酸(α-KG)是一种重要的二羧酸：在三羧酸循环中参与氨基酸的形成，在氨基酸代谢中参与氮的运输；同时，α-KG在有机合成如杂环构建，药物领域如保健品、伤口愈合成分中都有广泛的应用[1]。常见的α-KG的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法和生物转化法。化学合成α-KG需要经过多步反应，且合成过程使用的氰化物与伴随产生的有毒副产物极度污染环境[2]。微生物发酵以正链烷烃，或者乙醇、甘油等为底物，由于各种副产物的分离提高了生产成本，仍处于实验室研究阶段[3-4]。生物转化法尤其是酶催化具有以下特点：第一，酶催化化学选择性、区域选择性、立体选择性高，有利于提高生产效益；第二、酶催化反应条件温和，常在常温常压和水中进行，更加安全且无污染。综上所述，酶法生产α-KG具有很好的前景。

工业上L-谷氨酸产能过剩(2018年，我国L-谷氨酸的产量大约250万t)，因此以廉价的L-谷氨酸为原料生产α-KG是极有优势的。L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、L-氨基酸氧化酶(LAAO)、L-谷氨酸脱氢酶(L-GluDH)被报道可用于酶法转化L-谷氨酸生产α-KG。其中，来自奇异变形菌(Proteusmirabilis)的LAAO对L-谷氨酸的底物特异性差且酶活受到产物α-KG的严重抑制[5]，来自链霉菌(Streptomycesspecies)的LGOX酶活较低，需要优化异源表达所用的载体和宿主以期提高其表达量及酶活[6]。L-GluDH可以催化L-谷氨酸和α-KG间的可逆反应，因此在L-GluDH催化L-谷氨酸氧化脱氨过程中需要构建氧化型烟酰胺辅因子NAD+再生过程[7-8]以降低成本的同时推动反应朝生成α-KG的方向进行，最常用的方法是耦联NADH氧化酶[9]，但双酶耦联时对酶促反应速率的匹配要求限制了其大规模应用。最近研究发现金属有机配合物如铑配合物[10]、铁卟啉[11]等可以作为NADH氧化酶类似物再生NAD(P)+，但由于金属有机配合物具有成本高、易导致酶失活、后处理比较困难等缺点，不适用于大规模工业化生产。课题组前期的工作发现，人工黄素类似物——桥联黄素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基异咯嗪氯化物(F4)能高效再生NAD(P)+，且结构简单、水溶性好、不影响酶活[12]。因此，笔者拟采用F4再生NAD+耦联L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸至α-KG，技术路线见图1。通过单因素考察结合响应面法，以α-KG收率为目标，优化酶促反应条件。

图1 桥联黄素再生烟酰胺辅因子(NAD+)耦联 L-谷氨酸脱氢酶产α-KGFig.1 The coupled system of enzymatic converting sodium L-glutamate monohydrate(MSG) to α-KG employing F4 for NAD+ regeneration

1 材料与方法

1.1 原料

L-谷氨酸钠和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)(分析纯)，Aladdin公司；α-酮戊二酸钠盐(分析纯)，Sigma公司；柠檬酸、柠檬酸钠、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3和NaCl(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷(分析纯)、胰蛋白胨、酵母提取物和卡那霉素，生工生物工程(上海)有限公司；盐酸(分析纯)，西陇化工股份有限公司。

1.2 酶的来源

过氧化氢酶及来自变形杆菌(Proteusspecies)的L-谷氨酸脱氢酶，Sigma公司；来自艰难梭菌(Clostrdiumdifficile)CICC 22951的L-谷氨酸脱氢酶由实验室筛选得到。

1.3 桥联黄素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基异咯嗪氯化物(F4)的合成

参照文献[12]的方法制备桥联黄素。

1.4 来源于艰难梭菌(Clostrdium difficile)的L-谷氨酸脱氢酶的制备

参照文献[13]的方法制备来源于艰难梭菌的L-谷氨酸脱氢酶：构建大肠杆菌重组菌BL21(DE3)-pET28a-GluDH，在含0.1%卡那霉素的LB液体培养基中进行培养(37 ℃，200 r/min，12 h)至OD600为0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为0.6 mmol/L)进行诱导产酶(25 ℃，200 r/min，24 h)，经破碎、离心、过滤、Ni-NTA纯化柱纯化、超滤过程后得到纯酶液，测定酶活后使用。

1.5 桥联黄素再生烟酰胺类辅因子与L-谷氨酸脱氢酶耦联体系

以10 mL反应体系为例：15 mmol/L L-谷氨酸钠、1 mmol/L NAD+、1 mmol/L F4，pH 9三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液，过氧化氢酶50 U/mL，加入L-谷氨酸脱氢酶5 U/mL启动反应，反应液与外界空气相通。分别取反应4、8、12和24 h的反应液 200 μL，加入800 μL水稀释，过0.22 μm水系滤膜后利用液相检测反应进程。

1.6 分析方法

1)谷氨酸脱氢酶酶活测定。1 mL反应体系如下：3 mmol/L L-谷氨酸钠、0.2 mmol/L NAD+、100 mmol/L、Tris-HCl缓冲溶液(pH 8)，加入适量L-谷氨酸脱氢酶酶液启动反应，利用紫外-可见分光光度计测定波长340 nm处NADH吸光度的变化ΔA。酶活定义：在L-谷氨酸氧化反应中每分钟内催化生成1 μmol NADH所需的酶量为一个单位，酶活计算见式(1)。

(1)

式中：ΔA表示1 min内吸光值的变化；V表示反应体系总体积,mL；6 220 为摩尔消光系数，L/(mol·cm)；l表示光程为1 cm。

2)α-酮戊二酸的检测。采用HPLC法定量分析反应产物α-KG，色谱条件如下：有机酸柱Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，流动相为5 mmol/L H2SO4，进样量10 μL，流速0.6 mL/min，柱温35 ℃，紫外检测器的波长为205 nm，α-KG的保留时间为8.674 min。

3)α-酮戊二酸收率计算。利用外标法定量分析液相检测结果，配制一系列质量浓度为0.2～2.7 g/L的α- KG标准溶液，检测不同质量浓度下α-KG对应的峰面积，得到峰面积对α-KG浓度的标准曲线。利用此标准曲线计算不同反应时间的峰面积所对应的α-KG浓度，α-KG收率的计算见式(2)。

α-KG收率=HPLC外标法测得的产物浓度/L-谷氨酸的起始浓度 ×100%

(2)

2 结果与讨论

2.1 单因素考察

由于酶对特定底物的活性与酶的来源相关，同一种酶的酶活受缓冲液类型的影响，且L-GluDH的活性还受到产物α-KG、NADH的抑制[14]，而F4的用量会间接影响体系内NADH的浓度，体系pH对酶的活性及产物α-KG的稳定性也有显著的影响，因此需要考察L-GluDH的来源、缓冲溶液类型、NADH及F4用量、体系pH对α-KG收率的影响。

2.1.1 来源不同的L-谷氨酸脱氢酶对反应的影响

来自艰难梭菌的L-GluDH受到的抑制作用较小[11]，因此对比了来自艰难梭菌(Clostrdiumdifficile)的L-GluDH以及商品化的来自变形杆菌(Proteusspecies)的L-GluDH与F4耦联时的α-KG收率，结果见图2。由图2可知：来自艰难梭菌的L-GluDH显示出高的催化活性，因此选用来自艰难梭菌的L-GluDH作为酶源，F4耦联来自艰难梭菌的L-GluDH反应24 h α-KG收率达92%左右(产量2.02 g/L)，高于NADH氧化酶、三价铁卟啉作为再生催化剂时的结果，初步证实F4作为NAD+再生催化剂耦联L-GluDH具有很大优势。

图2 L-谷氨酸脱氢酶的来源对α-KG收率的影响Fig.2 Effects of the source of L-glutamate dehydrogenase on yield of α-ketoglutarate

2.1.2 不同类型缓冲液、NAD+的浓度、桥联黄素浓度、pH对反应的影响

考察不同类型缓冲液、NAD+的浓度、桥联黄素浓度、pH对α-KG收率的影响，结果见图3。由图3可知：在pH缓冲范围不同的柠檬酸缓冲(CPBS)、K2HPO4/KH2PO4缓冲(KPi)、羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲(Tris-HCl)、碳酸盐缓冲(CBS)条件下，L-GluDH催化L-谷氨酸的能力不同，Tris-HCl与L-GluDH的相容性最好，因此选择Tris-HCl 作为缓冲液。

当NAD+的浓度为1 mmol/L时，α-KG收率达到最大值。随着NAD+浓度的增加，α-KG收率反而在明显下降，这是因为生成的NADH没有立刻被F4再生成NAD+，导致NADH浓度过高，从而抑制了L-GluDH的活性，因此选择NAD+的浓度为1 mmol/L继续探究F4的用量。

当F4的浓度为1 mmol/L时，α-KG收率相对较高，当继续增加F4用量，α-KG收率显著下降，说明F4具有通过氧化NADH到NAD+来降低NADH对L-GluDH抑制的作用，但过高的F4可能也会对L-GluDH产生抑制作用。因此需要继续探究NAD+和F4的使用比例，找到α-KG收率变化的拐点所对应的NAD+浓度和F4浓度。

当pH为8或9时，α-KG收率都较高，pH为9时，中间反应过程明显比pH 8时的快，但随着时间的延长，由于α-KG在碱性强的条件下容易分解，α-KG收率增高幅度逐渐变慢。

图3 不同因素对α-KG收率的影响Fig.3 Effects of different factor on yield of α-KG

2.2 响应面设计

为了能更好地满足工业化生产α-KG的要求，使用响应面分析法对工艺条件进行优化，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken design[15]模块，结合单因素实验的结果，设计三因素三水平实验，考察NAD+的浓度(A)、F4的浓度(B)和pH(C)对α-KG收率的影响，根据实验方案进行15组平行实验(表1)，以α-KG收率为响应值进行回归模拟得到二次回归方程：

产率=95.57+2.20A+9.01B+4.66C-3.65AB-4.10AC-2.32BC-13.15A2-13.32B2-11.22C2。

方差分析(ANOVA)和F检验的结果见表2。由表2可知：模型P<0.05，达到显著水平，而失拟项P=0.066 7>0.05，模型失拟不显著，说明该方程拟合度高，可用于α-KG收率的分析预测。从P值大小可以看出：一次项B、C，交互项AB、AC，二次项A2、B2、C2对α-KG收率影响显著，说明各因素对α-KG收率影响不是简单的线性关系，且其中F4浓度(B)对α-KG收率有很大的影响(P=0.000 2<0.05)。

考察因素间交互作用对α-KG收率的影响，结果见图4～6。由图4可知：NAD+和F4浓度对α-KG收率影响显著，且在一定范围内α-KG收率随着NAD+和F4的浓度增高而增高，过高的NAD+和F4浓度都不利于α-KG的生产，与单因素试验的结果相符合；pH过小或者过大都对α-KG收率都是不利的，在略偏碱性的条件下有利于α-KG的生产和稳定。同时由等高线图可知，回归模型存在稳定点，即为α-KG最高收率，利用回归方程预测最高α-KG收率为97.4%(产量2.14 g/L)，对应的工艺参数条件：NAD+浓度1 mmol/L，F4浓度1.16 mmol/L，pH 8.17，修正取整后(NAD+浓度1 mmol/L，F4浓度1 mmol/L，pH 8)进行实验验证发现，24 h后α-KG的收率达到96.4%(产量2.11 g/L)，与模型预测基本一致。相比文献[9]报道的NADH氧化酶酶法再生NAD+与L-谷氨酸脱氢酶耦联生产α-KG，收率提高了15%左右。在最优条件下，在1 L的气升式发酵罐中放大反应，利用来自艰难梭菌的L-谷氨酸脱氢酶在Tris-HCl缓冲液环境下催化15 mmol/L的L-谷氨酸进行氧化脱氨反应，24 h后α-KG的收率为92%(产量2.02 g/L)，说明该模型能够较为正确地预测出各因素对α-KG收率的影响，以用于指导α-KG的工业化生产。

表1 响应面实验设计及结果

表2 回归方程的方差分析

图4 NAD+浓度和F4浓度对α-KG收率的影响Fig.4 Effects of NAD+ and F4 concentration on yield of α-KG

图5 NAD+浓度和pH对α-KG收率的影响Fig.5 Effects of NAD+ concentration and pH value on yield of α-KG

图6 F4浓度和pH对α-KG收率的影响Fig.6 Effects of F4 concentration and pH value on yield of α-KG

3 结论

桥联黄素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基异咯嗪氯化物(F4)能高效再生NAD(P)+，且结构简单、水溶性好、不影响酶活，利用F4耦联L-谷氨酸脱氢酶，构建新型α-KG生产体系。通过单因素考察响应面法优化反应条件，得出最佳参数：NAD+浓度1 mmol/L、F4浓度1 mmol/L、pH 8，在底物L-谷氨酸浓度为15 mmol/L条件下放大反应24 h后，α-KG的收率为92%(产量2.02 g/L)，同时NAD+的用量从2 mmol/L降低至1 mmol/L，降低了生产成本，该耦联体系为得到高产量的α-KG提供了一种新途径。同时再次证明，F4有望与更多依赖NAD+的氧化还原酶反应体系兼容，如与甘油脱氢酶耦联催化甘油至高附加值的1，3-二羟丙酮，具有广阔的应用前景。