甘油葡萄糖苷αGG抗氧化性能及其对UV致细胞损伤保护修复的研究

陈 思，徐 铮，李梁斐，李 莎，徐 虹

(1.南京工业大学 食品与轻工学院 材料化学与工程国家重点实验室，江苏 南京 211800；2.江苏省先进生物与化学制造协同创新中心，江苏 南京 211800)

甘油葡萄糖苷(2-O-(α-D-glucopyranosyl)-sn-glycerol，αGG[1-2])，是一种糖苷化合物，由葡萄糖基和甘油基以糖苷键连接而成，是沙漠植物细胞在外界胁迫条件下合成的一种渗透压调节剂(osmolyte)。它可以保护细胞免受高渗、高温、干旱和紫外线等恶劣环境的破坏[3]。在日本清酒、味增和米醂中，也发现含有活性成分αGG[4-5]。由于低吸水性、高保湿性等特点，αGG可用作化妆品原料，提高皮肤保湿效果[6-7]。另外，αGG还是一种良好的化妆品添加剂，具有保湿、抗氧化和抗衰老等功效[8-9]，可以消除化妆品洁面后的皮肤紧绷感[10]。

海藻糖(Tre)是一种安全、可靠的天然糖类，它是由2个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。卷柏作为一种复苏植物，其抗氧化系统在复苏过程中启动其保护酶防御机制抵抗水分胁迫，而海藻糖在卷柏保护生物分子过程中发挥着重要作用[11]。因此，在本研究中，笔者将海藻糖与αGG对3种自由基的清除效果作对比，并建立紫外辐射对L929细胞的损伤模型，研究αGG对受紫外损伤细胞的保护及修复作用[12-13]，希望为αGG在抗衰老型化妆品领域的产品开发提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

αGG(分析纯，AR)，德国Bitop AG公司；海藻糖(食品级)，德州汇洋生物科技有限公司；焦性没食子酸(邻苯三酚)、浓盐酸、H2O2、七水合硫酸亚铁、水杨酸、乙醇均为分析纯AR，中国医药(集团)上海化学试剂公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、DMEM高糖培养基、青链霉素、胰酶-EDTA、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2 (MTT)均为生物试剂BR，上海化学试剂公司；小牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；DCFH-DA荧光探针，南京建成生物工程研究所；去离子水，实验室自制。

752 S型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；Multiskan GO型酶标仪、Heracell 150i型细胞培养箱、Lumina荧光分光光度计，Thermo Scientific公司；HH-3A型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；KQ 5200型超声波清洗器，南京实验仪器厂；BSA 224S型分析天平，上海天平仪器厂；SW-CJ-1B标准型净化工作台，苏州净化设备厂；紫外光辐照计，北京师范大学光电仪器厂 。

1.2 抗氧化活性测定

1.2.1 清除DPPH自由基(DPPH·)的能力测定

DPPH·是一种比较稳定的自由基，被广泛用于测定多糖样品的抗氧化能力[14-15]。配制DPPH的乙醇标准溶液，分别加入20、10、5、4、2、1和0.5 mg/mL的αGG及海藻糖溶液，摇匀，室温静置20 min，在517 nm处使用酶标仪测定吸光值A1。不同浓度的αGG及海藻糖溶液与体积分数95%乙醇溶液混合测得吸光值A2，蒸馏水与150 μL DPPH溶液混合后的吸光度A0为对照。平行测定3次，取平均值，计算见式(1)。

(1)

式中：A0为50 μL蒸馏水+150 μL DPPH溶液的吸光值；A1为50 μL样品溶液+150 μL DPPH溶液的吸光值；A2为50 μL样品溶液+150 μL 95%乙醇溶液的吸光值。

1.2.2 清除羟基自由基(·OH)的能力测定

选用Fenton反应法测定·OH清除率[16]。配制9 mmol/L的水杨酸-乙醇标准溶液，先加入9 mmol/L FeSO4，再分别加入20、10、5、4、2、1和0.5 mg/mL的αGG及海藻糖水溶液，最后加入8.8 mmol/L H2O2启动反应，摇匀，置于37 ℃中水浴反应30 min，以去离子水为空白对照，在510 nm下测定各待测样品的吸光值。考虑到样品本身的吸光值，以9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液100 μL、不同浓度的抗坏血酸样品溶液100 μL和100 μL去离子水作为样品调零。平行测定3次，取平均值，计算见式(2)。

(2)

式中：A0′为空白对照组的吸光值；Ax′为样品组的吸光值；Ax0′为未加显色剂样品组的吸光值。

(3)

式中：A0″为空白对照组的吸光值；Ax″为样品的吸光值。

1.3 αGG对L929细胞活力影响的检测方法

采用MTT(methylthiazole-trazolium)法[19]检测αGG对小鼠成纤维细胞的活力影响。一定浓度条件下，细胞可摄取MTT，并被线粒体脱氢酶(主要是琥珀酸脱氢酶)氧化形成蓝紫色的难溶性颗粒，而死细胞无此功能；该颗粒在培养液中不溶解，用二甲基亚砜(DMSO)溶解颗粒，然后用酶标仪测定吸光值，其吸光值与细胞活力成正比[20]。

L929以2×104每孔的密度种于96孔板中，分为4组，每组5个孔，实验分组情况：对照组(CK)、αGG及海藻糖质量浓度分别为20、10和5 mg/mL。培养24 h后，每孔加入50 μL MTT溶液，在37 ℃、5% CO2的生化培养箱孵育4 h，将MTT还原为甲月臜。取出后，吸取上清液，每孔加入200 μL DMSO溶解甲月臜，振荡10 min。在490 nm处检测吸光值，细胞存活率以RT/C表示,具体计算见式(4)。

(4)

式中：T为处理过的细胞吸光值，C为正常对照细胞的吸光值。

1.4 紫外保护模型和修复模型的建立

紫外保护模型的建立：将L929细胞接种到96孔培养板中，分成8组(标记为A1、A2、B1、B2、B3、C1、C2和C3)，每组5个平行。其中，A组不加样品，B组加不同浓度αGG样品，C组加不同质量浓度海藻糖样品(20、10和5 g/L)，在细胞培养箱中培养24 h，弃上清液，经PBS溶液清洗后，加入等体积PBS溶液，细胞培养板在距离紫外灯10 cm处辐照30 min(辐照剂量5 J/cm2)，其中A1组用锡箔纸覆盖以阻隔紫外辐射。紫外辐照结束后，弃去PBS，加入37 ℃预热过的DMEM完全培养基培养24 h。取出孔板观察细胞形态。弃上清液，通过MTT法测定各孔的吸光度。然后使用吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色法(AO/EB)对细胞进行染色，并在荧光显微镜下进行观察[21]。

紫外修复模型的建立：将L929细胞接种到96孔培养板中，分成8组(标记为A1、A2、B1、B2、B3、C1、C2、C3)，每组均加入DMEM完全培养基，5个平行，在细胞培养箱中培养24 h。弃上清液，经PBS溶液清洗后，加入等体积PBS溶液，进行紫外辐照(A1组用锡箔纸覆盖)，细胞培养板在距离紫外灯10 cm处辐照30 min(辐照剂量5 J/cm2)。辐照结束后弃去PBS，清洗后在每孔中加入培养基，其中，A组不加样品，B组加不同浓度αGG样品，C组加不同质量浓度海藻糖样品(20、10、5 g/L)，再培养24 h。取出孔板观察细胞形态。弃上清液，通过MTT法测定各孔的吸光度。然后使用吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色法(AO/EB)对细胞进行染色，并在荧光显微镜下进行观察。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化活性测定

2.1.1 清除DPPH·的能力结果

抗氧化剂通过转移传递电子或氢原子给DPPH·来中和其自由基，对DPPH·的清除效果可以反映抗氧化剂的供氢能力。本实验中，DPPH·用来考察αGG样品清除质子的能力，结果如图1所示。由图1可知：αGG、海藻糖对DPPH·均具有一定的清除能力，在试验质量浓度内，DPPH·清除率呈现一定的剂量依赖性。αGG质量浓度越高，DPPH·清除率越强；相同质量浓度时，αGG、海藻糖对于DPPH·的清除率由大到小为αGG、海藻糖；当其质量浓度均为20 mg/mL时，αGG以及海藻糖对于DPPH·清除率分别为29.8%和9.2%。因此，αGG对DPPH·的清除能力远优于海藻糖。

图1 αGG和海藻糖清除DPPH·的能力Fig.1 DPPH· scavenging properties of αGG and trehalose

2.1.2 清除·OH的能力

羟基自由基被认为是最有害的自由基，是造成氧化伤害的主要原因。本实验中，利用水杨酸捕捉H2O2与Fe2+混合产生·OH的方法，检测αGG对·OH的清除作用，以抗坏血酸作为清除·OH的标准品对照，结果如图2所示。由图2可知：αGG、海藻糖对·OH均具有一定的清除能力，在试验质量浓度内，·OH清除率呈现一定的剂量依赖性，αGG质量浓度越高，·OH清除率越强。当其质量浓度均为20 mg/mL时，αGG以及海藻糖对于·OH清除率分别为80.0%和87.2%。因此，αGG对·OH的清除能力稍弱于海藻糖。

图2 αGG和海藻糖清除·OH的能力Fig.2 ·OH scavenging properties of αGG and trehalose

图3 αGG和海藻糖清除的能力 scavenging properties of αGG and trehalose

2.2 αGG对L929细胞活力的影响

**表示P<0.01 vs CK图4 αGG和海藻糖对L929细胞存活率的影响Fig.4 Effects of αGG and trehalose on L929 cell viability

在L929细胞培养过程中加入不同质量浓度的αGG或海藻糖溶液，考察培养24 h后αGG和海藻糖对细胞生长的影响，结果如图4所示。由图4可知：当培养基中加入海藻糖时，随着海藻糖浓度的增加，吸光度未发生显著性下降，说明在0～10 g/L范围内，海藻糖对细胞无抑制作用，当质量浓度达到20 g/L时，细胞存活率略有下降，但L929细胞增殖也未受到抑制。同样，培养基中加入αGG对细胞正常生长没有影响，且细胞数量随αGG质量浓度的增加而增多。当αGG达到10 g/L时，细胞存活率已经较对照组增加到128.7%，当αGG增加到20 g/L时，细胞存活率从对照组的100%增加到129%。结果表明，一定浓度的海藻糖和αGG对L929细胞的生长都无抑制作用，且大于10 g/L的αGG极大地促进L929细胞的生长；而浓度逐步提高时，海藻糖对L929细胞增殖未有抑制作用，且促生作用有限。

2.3 αGG对受紫外损伤细胞的保护及修复能力

紫外照射会严重损伤真皮层中的成纤维细胞，皮肤成纤维细胞的增殖能力对皮肤的正常修复起着决定性作用。笔者分别测定了不同质量浓度的αGG和海藻糖对紫外照射后L929细胞的保护与修复作用，其中保护作用是指先加保护剂再进行辐照，修复作用是指先进行辐照再添加保护剂，并分别对细胞存活率以及细胞形态进行研究。

图5 αGG和海藻糖对受紫外损伤细胞的保护作用Fig.5 Protection effects of αGG and trehalose on UV damaged cells

利用建立的L929细胞紫外辐射模型，考察αGG对紫外辐射损伤细胞的保护作用，结果如图5所示。由图5(a)可知：当αGG达到20 g/L时，经过辐照的L929细胞存活率达到90.5%；而培养基未添加αGG的L929细胞存活率仅为56.7%，添加海藻糖的L929细胞存活率也仅为52.5%。因此，αGG具有保护紫外辐照后L929细胞活性的作用。由图5(b)可以看出：未经紫外辐照的L929细胞，经染色后呈现绿色荧光，当L929细胞经紫外辐照30 min后，经染色后出现红色荧光；然而，当在L929细胞中添加5～20 g/L的αGG，再经30 min的紫外辐照后，相比未添加αGG仅辐照组，其红色荧光明显减少，海藻糖组红色荧光没有显著变化，这与MTT分析结果相符合。说明αGG具有保护紫外辐射后的细胞活性作用。

利用建立的L929细胞紫外修复模型，考察αGG的紫外修复作用，结果如图6所示。由图6(a)可知：当αGG达到20 g/L时，经过辐照的L929细胞存活率达到87.6%，而培养基未添加αGG的L929细胞存活率仅为56.7%，添加海藻糖的L929细胞存活率也仅为48.6%。因此，αGG具有修复紫外辐照后L929的细胞活性的作用。由图6(b)可知：当在L929细胞经过紫外辐照之后添加含有5～20 g/L的αGG培养基，相比未添加αGG仅辐照组，其红色荧光明显减少，海藻糖组红色荧光没有显著变化，说明αGG具有修复紫外辐射后的细胞活性作用。

图6 αGG和海藻糖对受紫外损伤细胞的修复作用Fig.6 Repair effects of αGG and trehalose on UV damaged cells

3 结论

本文中，笔者通过酶法制得的αGG开展了抗氧化性能以及抗紫外损伤细胞修复、保护作用工作，得到了如下结论：

②αGG对L929细胞生长存在一定程度的增殖作用。当其质量浓度达到20 mg/mL时，细胞存活率相对提高29.0%。

③αGG对L929细胞抗紫外损伤具有一定程度的修复及保护作用。对于预添加αGG的细胞，存活率较未添加的细胞，从56.7%提高至90.5%，提高了59.6%，说明αGG对于L929细胞抗紫外损伤存在保护作用。对于后添加αGG的细胞，存活率较未添加的细胞，从56.7%提高至87.6%，提高了54.5%，说明αGG对L929细胞抗紫外损伤存在修复作用。

目前，αGG作为天然的保湿剂，在食品、药品以及化妆品中尚未得到有效开发，本文的研究工作有望为αGG在保湿、抗衰老化妆品以及药品添加剂等方面提供相关依据。