响应面法优化超声提取-原子吸收光谱法测定海鱼中的铬

2021-04-14邓政义

沈阳医学院学报 2021年2期

邓政义

（锦州市疾病预防控制中心理化检验科，辽宁锦州121000）

海鱼种类丰富、味道鲜美、营养价值高，深受人们喜爱，是百姓餐桌上常见的菜肴。但近年来海洋污染日益严重，特别是重金属超标现象普遍存在［1］，而处于海洋生物食物链顶端的海鱼最容易富集重金属，并通过食物链进入人体［2］。铬（Cr）是人体内必需的微量元素，但如果长期摄入量超过一定值，也会对人体造成危害［3］。有研究显示，辽西地区食用鱼中Cr 等元素的每周可耐受摄入量（PTWI）约为10%，经常食用仍存在潜在危害［4］。因此对海鱼样品中重金属含量的测定是十分必要的。食品中重金属消解的常用方法主要有湿式消解法［5］、干法灰化法［6］和微波消解法［7］等，但这些方法存在着消解时间长、精密度低、需要高温高压条件等问题。超声提取法通过超声波在样品内部的“空穴” 作用，产生强烈的机械破碎、搅拌、振动、空化等作用［8］，加速样品的溶出，缩短预处理时间，提高样品提取率，有利于大批量样品的快速处理［9-10］。因此，本研究建立一种简便快速，且适用于鱼类样品中Cr 测定的方法—超声提取-原子吸收光谱法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器市售海鱼（带鱼、黄花鱼）；硝酸（HNO3）、高氯酸（HClO4）、 30%过氧化氢（H2O2）； 1 000 μg／ml Cr 标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）； GBW08573 黄鱼（国家标准物质中心）。

WYS2200 型原子吸收分光光度计（安徽皖仪科技股份有限公司）， KQ-100DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电热板（常州国宇仪器制造有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 超声提取法准确称取一定量的海鱼样品于离心管中，加入7 ml HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 70 ℃下超声提取20 min， 4 000 r／min 离心5 min，取上清液于电热板蒸发至约1 ml；残渣经超纯水清洗后再超声提取2 min， 4 000 r／min 离心5 min，取上清液合并于上述酸提取液中，去离子水定容于10 ml 比色管中，同时作空白试验。

1.2.2 湿式消解法准确称取一定量海鱼样品于高脚烧杯中，并放入数粒玻璃珠，加10 ml HNO3-HClO4（9 ∶1， V／V）加盖浸泡8 h 并于电热板上加热，直至冒白烟并且消化液呈透明，将过量的混酸蒸发近干。冷却，用滴管将消化液移入10 ml 容量瓶中，去离子水定容，混匀备用，同时作空白试验［11］。

1.2.3 石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）测定Cr的含量测定条件：波长258.2 nm，狭缝0.4 nm，灯电流10 mA，干燥温度110 ℃，干燥时间15／15 s；灰化温度1 000 ℃，灰化时间5／10 s；原子化温度2 600 ℃，原子化时间2／3 s；高温清洗温度2 650 ℃，清洗时间3／3 s。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素试验分别考察超声时间、超声温度、样品量和溶剂体积4 个影响海鱼中Cr 提取浓度的影响，以获得单因素试验最佳值。每次固定其中3 个因素，变化另1 个因素。因素变化范围为超声时间5 ～35 min，超声提取温度30 ～80 ℃，样品量0.05～0.30 g，溶剂体积1～9 ml。

1.3.2 中心组合设计（CCD）实验采用CCD 对单因素试验选出的最佳条件进行进一步优化。

1.3.3 数据分析利用Design-Expert.V8.0.6 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间的选择准确称取适量标准品（GBW08573 黄鱼）加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V），放入超声浴中，室温下超声5、 10、 15、 20、25、 30、 35 min，以考察超声时间对Cr 提取浓度的影响，结果见图1。 Cr 的提取浓度随着超声时间的增加而增大。当超声时间20 min 时， Cr 的提取浓度均接近最大值，再增加超声时间对Cr 提取浓度影响不大。因此，本实验选择超声提取20 min。

2.1.2 超声温度的选择选择超声时间为20 min，准确称取适量标准品加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V），分别在30、 40、 50、 60、 70、 80 ℃温度下超声提取，考察超声温度对Cr 提取浓度的影响，结果见图2。 Cr 的提取浓度均随着超声温度的升高而增大，当超声温度为70 ℃时， Cr 的提取浓度达到最大值。因此，本实验选择超声温度70 ℃。

2.1.3 样品量的选择选择超声时间为20 min、超声温度为70 ℃下，分别准确称取0.05、 0.10、0.15、 0.20、 0.25、 0.30 g 的标准品加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V），考察样品量对Cr 提取浓度的影响，结果见图3。 Cr 的提取浓度均随着样品量的增加而减小，说明单位体积的溶剂对重金属的提取量是有限的。当样品量多于0.15 g 时， Cr的提取浓度明显减少。因此，本实验选择样品量0.10 g。

2.1.4 溶剂体积的选择选择超声时间20 min、超声温度为70 ℃下，准确称取0.10 g 标准品分别加入1、 3、 5、 7、 9 ml 的HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V），考察溶剂体积对Cr 提取浓度的影响，结果见图4。 Cr 的提取浓度均随着溶剂体积的增大而增大，但溶剂用量大会增加成本。综合考虑重金属提取浓度和测定成本，本实验选择溶剂体积为7 ml。

2.2 CCD 实验及分析

2.2.1 回归模型的建立根据CCD 原理设计4 因素3 水平共30 组实验，因素和水平见表1，实验结果见表2，方差分析结果见表3。实验数据回归拟合得到回归方程为： Cr 提取浓度＝＋0.38 ＋0.063A＋0.044B-0.031C＋0.00375D-0.006875AB-0.006875AC-0.005625AD-0.012BC-0.003125BD＋0.019CD-0.032A2-0.016B2-0.043C2-0.024D2（A 为超声时间， B 为超声温度， C 为样品量， D为溶剂体积）。回归模型的一次项A、 B 为极显著（P＜0.01）， C 为显著；交互项CD 为显著；二次项A2和C2为极显著， B2和D2为显著。并且二次回归模型P＜0.01，说明回归方程关系为极显著；失拟项为0.3483＞0.05 表明失拟不显著，此方程拟合较为合理。回归模型的R-Squared ＝0.947 4，Adj R-Squared ＝0.898 4，说明此模型与实际拟合程度较为相符，用此模型分析和预测Cr 的超声提取工艺合适。 Pred R-Squared ＝0.754 5，与Adj R-Squared合理一致。模型的信噪比Adeq Precision＝15.377＞4，说明此模型具有足够的信号以响应此实验设计。

图1 超声时间对Cr 提取浓度的影响

图2 超声温度对Cr 提取浓度的影响

图3 样品量对Cr 提取浓度的影响

图4 溶剂体积对Cr 提取浓度的影响

续表2

表3 CCD 方差分析

2.2.2 响应面分析利用响应面分析确定4 个因素交互作用对Cr 提取浓度的影响。两两因素交互作用的响应面图见图5 所示。通过比较可见， C（样品量）与D （溶剂体积）响应面坡度最为陡峭，说明C 和D 两因素交互作用显著。其它因素交互作用影响不显著。由软件预测的最佳超声提取条件为：超声时间29.79 min，超声温度80 ℃，样品量0.07 g，溶剂体积6.28 ml， Cr 提取浓度理论值为0.45 mg／kg。考虑实际操作条件，适当修正超声提取条件为：超声时间30 min，超声温度80 ℃，样品量0.07 g，溶剂体积6.50 ml，验证结果表明， Cr 浓度为0.41 mg／kg。实验值与预测值比较相符，说明此模型可靠，超声辅助提取海鱼中Cr 可行。

2.3 2 种消解方法的比较分别采用超声提取法和湿式消解法处理标准品，取6 次平行的实验结果。湿式消解法测定结果为： Cr 浓度0.37 mg／kg，回收率为87.1%，相对标准偏差（RSD）为5.6%。超声提取法测定结果为： Cr 浓度0.39mg／kg，回收率为96.4%，相对标准偏差（RSD）为4.4%。 2 种方法的测定结果均与标准品参考值（0.43 mg／kg）相符。

图5 各因素交互作用的响应面图

2.4 样品的测定取海鱼样品可食用部分，流水冲洗，去离子水清洗，晾干，捣碎混匀。在选择的最佳超声提取条件下，分别用超声提取法和湿式消解法测定样品中Cr 的含量。湿式消解法测定结果为：带鱼中Cr 为0.21 mg／kg，黄花鱼中Cr 为0.30 mg／kg。超声提取法测定结果为：带鱼中Cr为0.19 mg／kg，黄花鱼中Cr 为0.23 mg／kg。根据食品安全国家标准《食品中污染物限量》（GB 2762-2017）［12］对水产动物及其制品中Cr 的限量标准为≤2.0 mg／kg，所检测的带鱼和黄花鱼样品中， Cr 的含量均未超过国家限量标准。