腹膜透析患者腹主动脉钙化与外周血淋巴细胞亚群的相关研究

任彩霞 韩昆 刘媛 邢文秀 鹿恩邦 巩雪 万美燕

1青岛大学 266071；2青岛市市立医院肾内科 266011

钙化是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的一个显著特征，与心血管疾病和全因死亡率密切相关[1]。尿毒症毒素、代谢紊乱、微量元素异常等对腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)患者免疫系统造成很大影响[2]。慢性肾衰竭特别是尿毒症患者整个免疫系统均发生复杂的变化，包括天然性免疫和获得性免疫，既有免疫激活(细胞因子和急性期蛋白增高)，又有免疫抑制(对感染和肿瘤免疫反应障碍，疫苗接种后抗体生成率低)。近来发现，免疫炎症通过诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨细胞转化、调节骨代谢因子的表达在血管钙化(vascular calcification，VC)的发病机制中发挥重要作用。尽管大量证据表明巨噬细胞是引发VC的关键成分，但天然性免疫细胞和获得性免疫细胞之间的相互作用尚未得到充分论证[3]。本研究以PD患者为研究对象，分析影响腹主动脉钙化(abdominal aortic calcification，AAC)的相关因素以及淋巴细胞亚群与AAC的关系，并进一步探讨天然性和获得性免疫在AAC发病中的作用。

资料与方法

一、研究对象

纳入2018年9月至2019年10月在青岛市市立医院肾内科确诊为尿毒症并进行PD治疗的患者作为研究对象。入选标准：持续不卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)至少3个月且年龄大于18岁，所有患者均使用广州百特医疗用品有限公司生产的低钙腹膜透析液(Na+132 mmol/L，Cl-95 mmol/L，Mg2+0.25 mmol/L，Ca2+1.24 mmol/L，乳酸根40 mmol/L)，透析方式为CAPD，每天换液4次，每次2000 mL，透析剂量为8 L/d，透析龄为44.10(13.20，54.00)个月。排除标准：(1)近3个月内发生感染或使用抗生素；(2)近3个月内使用激素或免疫抑制剂；(3)近3个月内有过手术或创伤史；(4)有精神疾患或无法配合者；(5)其他严重疾病，如恶性肿瘤、严重营养不良[4]、动脉瘤、主动脉夹层、肺动脉高压等。本研究经青岛市市立医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1.一般资料收集 记录患者性别、年龄、透析龄、原发病(高血压肾病、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎等)、用药情况、透析前血压等。

2.血标本收集 所有入选的患者抽血检查前禁食8 h，于PD治疗前留取血标本，送至我院检验科检测各项血生化指标包括血红蛋白、白蛋白、血清肌酐、尿素氮、甲状旁腺激素、血磷、血钙、碱性磷酸酶、超敏 C 反应蛋白、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等。

3.淋巴细胞亚群检测 所有入选的患者抽血检查前禁食8 h，于PD治疗前留取血标本，送至我院检验科使用流式细胞仪检测，分别得出CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD16+CD56+、Treg淋巴细胞比例及CD8+DR+淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值。

4.AAC评分测定 按照改善全球肾脏病预后组织(kidney disease improving global outcomes，KDIGO)指南建议，用侧位腹部X线片检测患者VC情况[5]。由放射科医师对患者进行腹部侧位X线平片检查，侧位片上以L1～L4范围内对应的主动脉为腹主动脉，以腰椎间隙为界分为L1～L4段，分别评价AACs。AACs的评定：采用Kauppla等[6]报道的半定量积分系统评分方法，分别评价L1～L4每个节段腹主动脉前壁、后壁钙化的严重程度，根据该节段钙化累及范围给予1分(范围<1/3)、2分(范围1/3～2/3)和3分(范围>2/3)，累积各节段的总得分即为该患者的AACs(0～24分)。分别由两位有经验的放射科医生对腹部侧位X平片进行评分，取平均值；若相差5分，则请第3位医生对其评分，取3个评分的平均值作为AACs。AACs分为无和轻度钙化组(0≤AACs≤4分)、中度钙化组(5≤AACs≤15分)和重度钙化组(16≤AACs≤24)。

三、统计学方法

采用SPSS22软件进行统计分析，对计量资料进行正态性及方差齐性检验，正态分布的数据资料以Mean±SD表示，若方差齐，多组间数据比较采用F检验，组间两两比较采用LSD检验；若方差不齐，多组间数据比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验；非正态分布数据采用以M(1/4，3/4)表示，采用秩和检验。计数资料采用卡方检验或者精确概率法。相关性研究采用Spearman相关性分析。Logistic回归分析患者AAC的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、病例资料

本研究纳入腹膜透析患者86例，年龄为(61.6±12.6)岁，其中男52例(60.50%)，39例(75%)发生AAC；女34例(39.53%)，29例(85.29%)发生AAC。原发病包括：糖尿病肾病35例(40.7%)，慢性肾小球肾炎34例(39.5%)，高血压肾病10例(11.6%)，其他原因7例(8.1%)。

二、不同程度AAC组间临床资料比较

86例PD患者中无和轻度钙化41例、中度钙化28例、重度钙化17例。3组患者年龄、原发疾病为糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎以及白蛋白、血磷、碱性磷酸酶水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其余生化指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。(表1)

表1 不同程度AAC组间临床资料比较

三、不同程度AAC组间外周血淋巴细胞亚群的比较

3组患者外周血CD8+DR+淋巴细胞计数、Treg细胞百分率、NK淋巴细胞百分率、CD4+/CD8+比值组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。(表2)

表2 不同程度AAC组间外周血淋巴细胞亚群的比较(Mean±SD)

四、AAC与各临床资料的相关性分析

PD患者AAC与年龄(r=0.352，P<0.05)、透析龄(r=0.284，P<0.05)、甲状腺激素(r=0.226，P<0.05)、血磷(r=0.299，P<0.05)、碱性磷酸酶(r=0.265，P<0.05)、超敏C反应蛋白(r=0.285，P<0.05)呈正相关，与白蛋白呈负相关(r=-0.222，P<0.05)。(表3)

五、AAC与淋巴细胞亚群的相关性分析

PD患者AAC与CD8+DR+淋巴细胞计数(r=0.292，P<0.05)、NK淋巴细胞百分率(r=0.228，P<0.05)、CD4+/CD8+比值(r=0.236，P<0.05)呈正相关，与Treg细胞百分率(r=-0.354，P<0.05)呈负相关，其余变量与AAC相关系数差异无统计学意义(P>0.05)。(表4)

表4 AACs与外周血淋巴细胞亚群的相关性

六、中重度AAC影响因素的多因素Logistic回归分析

以是否发生中重度AAC(AACs>4分)为因变量，将年龄、透析龄、甲状旁腺激素、血磷、碱性磷酸酶、超敏C反应蛋白、白蛋白、CD8+DR+淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值、Treg细胞百分率、NK淋巴细胞百分率作为自变量行二元Logistic回归分析，结果显示：高龄(OR=1.060，P=0.024)、CD4+/CD8+(OR=25.441，P=0.023)、Treg(OR=0.427，P=0.001)是AAC的独立预测因素。(表5)

表5 中重度AAC影响因素的多因素Logistic回归分析

讨 论

在CKD病程发展中，一系列病理反应如氧化应激、高磷血症、氮质血症以及透析等均会导致患者免疫功能改变，T淋巴细胞大量减少，表现出免疫功能下降的状态。当CKD发展至尿毒症，因毒素潴留、代谢紊乱等影响，免疫激活和免疫抑制两种状态并存[7]。虽然终末期肾衰竭患者存在T淋巴细胞激活，但T淋巴细胞免疫功能是不健全的[8]。免疫系统的慢性激活状态加速动脉粥样硬化、VC和诱发心功能不全[9]。淋巴细胞是构成免疫系统和执行免疫功能的主要细胞群体，进行淋巴细胞亚群分析对于了解机体免疫功能状态有重要意义。人体主要的淋巴细胞亚群可以分为T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群和NK淋巴细胞亚群。本研究证实了淋巴细胞亚群改变可能与PD患者的AAC有一定的关联性，为CKD患者AAC防治提供重要的线索及理论依据。

T淋巴细胞(CD3+)介导适应性细胞免疫应答，诱导体液免疫发挥辅助性作用。Th细胞(CD3+CD4+)即辅助性T细胞、Ts细胞(CD3+CD8+)即杀伤性T细胞，是来自两个不同亚群的功能性T淋巴细胞，在免疫应答中分别起着正向和负向调节作用。在机体中，CD8+淋巴细胞决定细胞免疫杀伤功能和组织损伤情况，而CD4+淋巴细胞影响细胞免疫分泌功能。所以，CD4+、CD8+淋巴细胞占据的百分率以及CD4+/CD8+比值是衡量人体细胞免疫功能的重要指标，只有在CD4+/CD8+比值正常，才确保机体免疫功能的正常，一旦出现比值下降或者倒置情况，就表明机体免疫功能出现紊乱[10]。Treg细胞(CD4+CD25+)即调节性T细胞，在调节免疫耐受和预防自身免疫性疾病中起着至关重要的作用。Treg细胞除了广为人知的抑制CD4+和CD8+淋巴细胞的活化功能，还抑制天然免疫细胞诸如单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞等[11-12]。本研究发现，PD患者AAC与活化的Ts细胞(CD8+DR+)计数、NK淋巴细胞百分率、CD4+/CD8+比值呈正相关，与Treg细胞百分率呈负相关，且多因素Logistic回归分析提示CD4+/CD8+、Treg细胞百分率为AAC的独立危险因素。有研究发现，激活的T淋巴细胞可产生细胞因子如γ-干扰素、转化生长因子(tumour necrosin factor,TGF)-β、肿瘤坏死因子(turnor necrasis factor,TNF)-α等炎性细胞因子，促进VSMC表达骨碱性磷酸酶和向成骨样表型转化，参与VC的调控[13]。通过检测骨碱性磷酸酶的活性和矿化基质发现，T细胞分泌TNF-α激活cAMP，诱导VSMC向成骨样细胞分化[14]。新近的研究发现，激活的T细胞表达核因子-κB 受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)可直接促进骨保护素的生成，骨保护素在抑制破骨细胞生成和VC中有重要作用，提示T细胞通过RANKL调节VC的发生[15]。Treg细胞通过产生TGF-β和IL-10抗炎细胞因子来降低免疫应答[16]。对间充质干细胞的研究表明，TGF-β促进VSMC分化，但在高磷酸盐条件下降低BMP2的表达[17]。还有研究表明，维持性血液透析患者冠状动脉钙化积分与Treg细胞百分率呈负相关[18]。

B淋巴细胞(CD3-CD19+)产生抗体发挥特异性体液免疫功能。B细胞通过分泌抗体和细胞因子参与钙化。既往研究证实，较高的血浆自身免疫性疾病相关抗体水平与较高的冠状动脉钙化水平相关[19]。本研究发现，3组不同程度AAC患者中B淋巴细胞百分率无明显差异，且AAC与B淋巴细胞百分率无明显相关性。与既往研究不一致，其原因可能是样本量不足，研究具有一定局限性和缺陷，仍需扩大样本量做进一步的深入研究。

NK淋巴细胞(CD3-/CD16+CD56+)即自然杀伤细胞，具有识别被病毒感染的细胞表面相应配体后施加杀伤的作用。NK细胞激活，释放细胞毒性分子、颗粒酶和穿孔素或通过死亡受体配体，导致靶细胞凋亡，参与VC发生、发展[20]。另一方面，NK细胞可通过释放γ-干扰素，TNF或IL-10等炎性细胞因子间接发挥作用。本研究发现，PD患者重度钙化和中度钙化组NK淋巴细胞百分率高于无和轻度钙化组，且NK淋巴细胞百分率与AAC呈正相关。总体而言，这些观察结果表明心血管钙化通过先天性和适应性免疫反应来综合调节。

导致CKD患者VC因素较多，传统危险因素有：老化、吸烟、高血压、高胆固醇血症和糖尿病等。除此之外，还有矿物质代谢紊乱、心血管组织过早衰老、炎症、氧化应激等非传统危险因素。本研究发现，AAC与年龄、透析龄、甲状旁腺激素、血磷、碱性磷酸酶、超敏C反应蛋白呈正相关(P<0.05)，与白蛋白呈负相关(P<0.05)。多因素Logistic回归分析提示患者年龄为AAC的独立危险因素，充分说明诸多因素在VC形成中的重要作用，与相关报道一致[21]。研究证实，衰老的VSMC中Runt相关转录因子2和碱性磷酸酶的表达显著上调，细胞向成骨细胞表型转化，同时年龄也是影响成骨细胞生长和矿化的独立因素，衰老内皮释放的囊泡可能通过沉积在胞外基质中促进基质矿化，或者进入血管平滑肌内部促进其发生成骨样转化[22]

综上所述，本研究表明，PD患者外周血淋巴细胞亚群构成比例与AAC程度密切相关，天然性和获得性免疫均参与了VC发生、发展，免疫治疗可能成为PD患者AAC的潜在治疗靶点。本研究为小样本单中心横断面研究，今后需加大样本量，多中心、前瞻性及回顾性研究来进一步探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突