慢性HBV相关肝病患者HBV基因型和耐药突变位点与疾病进展的关系

刘理冠 叶巧霞 严彦 颜燕燕 黄志杰 张小曼

核苷(酸)类似物(NAs)因抑制病毒复制能力强、使用方便和不良反应小等已成为我国治疗乙型肝炎的主要药物，主要包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)、阿德福韦酯(ADV) 和替诺福韦酯(TDF)[1]。但其也存在缺点，如停药困难，患者须长期使用，部分患者出现了NAs耐药，导致治疗失败[2]。究其原因发现与患者HBV反转录酶区(reverse transcriptase,RT)产生耐药突变有关，HBV-RT耐药突变可使机体发生病毒学和生化学突破，是慢性HBV相关肝病进展的重要原因[3-5]。此外，耐药突变可能与HBV基因型亦存在一定关联[6]。本研究探讨慢性HBV相关肝病患者HBV基因型和耐药突变位点与疾病进展的关系。

资料与方法

一、研究对象

选取2016年1月至2019年12月于解放军联勤保障部队第九一〇医院诊疗的慢性HBV相关肝病患者230例，其中男150例，女80例；年龄为18～79岁。慢性乙型肝炎患者175例，乙型肝炎相关肝硬化患者40例，乙型肝炎相关肝癌患者15例。纳入标准：①诊断参考《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和《原发性肝癌诊疗规范》[8]；②使用NAs治疗超过24周；③知情且签署知情同意书；排除：①合并甲、丙、丁及戊型肝炎病毒共同感染者；②合并酒精性肝病和或自身免疫性肝病。慢性乙型肝炎患者中，男120例，女55例；年龄为(54.8±11.3)岁；乙型肝炎相关肝硬化患者中，男29例，女11例；年龄为(55.0±11.2)岁；乙型肝炎相关肝癌患者中：男12例，女3例；年龄为(54.1±10.9)岁；3组患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

二、方法

(一)标本收集 抽取空腹静脉血，分离血清，储存于-80℃冰箱待用。

(二)HBV RT区测序 采用ABI 3500XL型基因测序仪检测血清HBV RT区核苷酸序列，试剂盒购自上海申友生物技术有限公司。具体操作如下：第一，HBV DNA提取，将血清标本复溶，取200 μL血清加入同等体积HBV DNA提取液I，振荡混匀，以13 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入 50 μL HBV DNA提取液II，充分混匀后短暂离心，100℃干浴或沸水浴10 min，振荡混匀，以15 000 r/min离心5 min，取4 μL上清液DNA作为 PCR反应模板。第二，PCR扩增，在配制好的反应液中加入标本DNA、对照及定量参比品各4 μL，并在ABI 7500 PCR仪上设好反应程序：50 ℃ 2 min，94 ℃ 8 min，94 ℃ 7 s,60 ℃ 50 s，45个循环，72 ℃ 2 min。第三，PCR产物酶解，取3 μL PCR产物加入2 μL SAP MIX，充分混匀，37℃反应60 min，80 ℃反应15 min，将产物保存于4 ℃。第四，测序，取3 μL阳性PCR酶解产物与1 μL测序试剂和2 μL测序引物混合进行测序PCR扩增，反应程序为：94 ℃ 1 min , (94 ℃ 10 s, 50 ℃ 5 s, 60 ℃ 4 min)×30个循环，4 ℃下使用乙醇将其纯化，并溶于甲酰胺溶液中。第五，DNA变性：在ABI 7500 PCR仪完成DNA变性，94 ℃ 5 min,4 ℃ 4 min。第六，基因测序及结果判断，将上述产物置于ABI 3500XL型基因测序仪上进行测序，用配套软件打开测序峰图，对rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236、rt250共8个耐药位点进行突变分析。

(三)HBV基因型检测 将上述 HBV-RT区核苷酸碱基序列与美国国立生物技术信息中心基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formage.cgi)中信息进行比对，获取HBV基因型。

三、统计学分析

结 果

一、慢性HBV相关肝病患者NAs耐药突变分析

230例慢性HBV相关肝病患者中100例(43.47%)检出NAs耐药突变，以LAM/LdT耐药最多见(30.00%,69/230)、ADV耐药次之(7.83%,18/230)、ETV耐药最少(5.65%,13/230)，三者比较差异有统计学意义(χ2=67.392,P<0.01)。在LAM/LdT耐药中，单点耐药55例(79.71%)，以rtM204V/I突变多见(17.39%,40/230)，其余还包括rtL180M突变8例和rtV173L突变5例；多点耐药14例(20.29%)，以rtL180M+rtM204V/I突变多见(5.65%,13/230)，其余还包括rtL180M+rtM204V/I+rt V173L突变3例。在ADV耐药中，以单点耐药为主(11例,占61.11%)，rtA181T是其主要突变位点(3.91%,9/230)，其余还包括rt236T突变1例、rtA181T+rt236T突变2例、rtL180M+rtA181T突变2例和rtL180M+rtA181T+rt236T突变4例。在ETV耐药中，均为多点耐药，以rtM204V/I+rtA181T+rtS202G/I突变为主(3.04%,7/230)，其余还包括rtM204V/I+rtA181T+rtT184A/G/I/S突变3例、rtM204V/I+rtL180M+rtA181T+rtT184A/G/I/S+rt250V/I突变2例和rtM204V/I+rtL180M+rtA181T+rt236T+rt250V/I突变1例。

二、慢性HBV相关肝病患者HBV基因型分析

230例慢性HBV相关肝病患者均为B基因型和C基因型，未检测到A、D、E、F、G、H、J基因型，其中B基因型患者162例(70.43%)，C基因型患者68例(29.57%)。

三、不同HBV基因型NAs耐药突变情况比较

HBV B基因型和C基因型在rt180突变率和rt181突变率上比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，但其他位点突变差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

四、不同HBV基因型疾病进展情况比较

慢性乙型肝炎组B基因型和C基因型分别为114例和51例，乙型肝炎相关肝硬化组B基因型和C基因型分别为12例和28例，乙型肝炎相关肝癌组B基因型和C基因型分别为5例和10例，HBV基因型在3组分布比较差异有统计学意义(χ2=25.012,P<0.01)。

表1 不同HBV基因型NAs耐药突变情况比较(例)

五、不同NAs耐药突变疾病进展情况比较

慢性乙型肝炎组、乙型肝炎相关肝硬化组和乙型肝炎相关肝癌组在rt204耐药位点上比较，差异有统计学意义(P=0.015)，但在其他位点上差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同NAs耐药突变疾病进展情况比较(例)

讨 论

研究表明，HBV疾病进展可能与基因型有关[9]。目前，根据HBV全基因序列差异≥8%和(或)S区基因序列差异≥4%进行分型，可将HBV基因型分为A-J10个基因型，而我国以B型和C型为主，其中南方以B型为主，北方以C型为主[10]。本研究中，230例慢性HBV相关肝病患者HBV B基因型约占70.43%，略高于张小曼等[11]的报道，可能与人群分布差异有关。此外，本研究还对比了HBV不同基因型患者疾病进展情况发现，HBV B基因型患者和HBV C基因型患者有一定差异，其中C型患者更易进展为肝硬化甚至是肝癌，可能是与C基因型患者HBV复制能力更强，肝功能损伤较重有关。

目前已明确的NAs耐药模式有6种，包括L型核苷耐药模式、无环磷酸盐耐药模式、共享(公共)耐药模式、双重耐药模式、ETV初治耐药模式和多药耐药模式[12]。由于经济原因，我国以低屏障耐药(LAM、LdT和ADV)为主，高屏障耐药(EVT)为辅，但无论是何种，均不利于HBV相关肝病治疗及恢复[13]。本研究对230例慢性HBV相关肝病患者NAs常见耐药突变点进行检测发现，以rt204位点突变占比最高，约69%，与国内主流意见基本一致，提示rt204位点突变者NAs耐药率高，提醒临床工作者可将HBV-RT区rt204位点突变检测纳入抗病毒疗效监测中，以便及时调整治疗方案，提高治疗效果。此外，本研究还发现230例慢性HBV相关肝病患者中rt180和rt181突变也相对较高，提示以上两者可成为耐药监测的另一检测指标。有学者发现，除了药物本身，耐药产生可能与病毒基因型具有一定关联[14]；但也有学者发现B 基因型和C基因型患者在耐药位点突变率上无明显差异[15]。本研究发现，除rt180位点和rt181位点外，HBV B基因型和C基因型在其他位点的突变率无明显差异，与上述观点基本一致，也提示C基因型患者更易发生rt180位点和rt181位点突变，导致耐药。此外，rt204位点突变对疾病进展更为重要，提示应重点关注rt204位点突变患者的疾病进展状况，尽可能采取有效措施减缓其进程。

综上，本地区慢性HBV相关肝病患者基因型以B型和C型为主，NAs主要耐药突变点检出率较高，其中不同基因型的疾病进展情况和耐药突变情况存在差异，而在rt204耐药位点突变率上不同疾病阶段亦存在差异，建议HBV感染者常规进行基因型和NAs耐药检测，以便建立个体化治疗方案，减缓疾病进程。本研究存在以下不足：①本地区样本量不足，尤以乙型肝炎相关肝癌者缺乏；②研究对象均为本院患者，可能存在一定地区差异性。