类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及巨自噬的表达水平

邵鑫　蒋先虹　王瑞　蒲强红　刘福

【摘 要】目的：探討体外原代培养的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）中是否存在巨自噬现象以及在类风湿关节炎（RA）中的发病机制。方法：培养原代RA-FLS，以骨关节炎（OA）患者膝关节滑膜组织中培养的骨关节炎滑膜成纤维细胞（OA-FLS）作为对照组。采用MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞仪检测细胞凋亡;采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白免疫印迹法（Western Blot）分别检测2组细胞中巨自噬标志性因子LC3、P62 mRNA及蛋白的相对表达水平，激光共聚焦显微镜检测LC3、P62蛋白的表达。结果：从患者膝关节滑膜组织中成功分离、培养出RA-FLS与OA-FLS，MTT结果显示，RA-FLS增殖活力明显强于OA-FLS;流式细胞仪结果显示，RA-FLS的细胞凋亡减少;RT-qPCR、Western Blot结果表明，RA-FLS与OA-FLS相比，LC3 mRNA及蛋白的相对表达水平升高、P62 mRNA及蛋白的相对表达水平降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）;激光共聚焦显微镜结果显示，RA-FLS中LC3表达更高，P62表达更低。结论：RA-FLS中LC3 mRNA及蛋白的相对表达水平明显增高，P62 mRNA及蛋白的相对表达水平显著降低，提示RA中巨自噬水平活化，这可能是导致RA-FLS出现凋亡抵抗，增殖活性明显高于OA-FLS的潜在原因。

【关键词】 关节炎，类风湿;骨关节炎;滑膜成纤维细胞;巨自噬;LC3;P62

Proliferation and Expression of Macroautophagy in Synovial Fibroblasts of Rheumatoid Arthritis

SHAO Xin，JIANG Xian-hong，WANG Rui，PU Qiang-hong，LIU Fu

【ABSTRACT】Objective：To investigate the existence of macroautophagy in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（RA-FLS）in vitro and its pathogenesis.Methods：Primary RA-FLS were cultured，and OA-FLS were used as a control group.MTT was used to detect cell proliferation activity;flow cytometry was used to detect cell apoptosis;RT-qPCR and Western Blot were used to detect the relative expression levels of LC3，P62 mRNA and protein in the two groups;and laser confocal microscopy was used to detect the expression levels of LC3 and P62.Results：RA-FLS and OA-FLS were successfully isolated and cultured from synovial tissue of knee joint.MTT results showed that the proliferation activity of RA-FLS was significantly stronger than that of OA-FLS.Flow cytometry results showed that the apoptosis of RA-FLS was reduced;RT-qPCR and Western Blot results showed that compared with OA-FLS，the relative expression levels of LC3 mRNA and protein of RA-FLS were higher，and P62 protein of RA-FLS was lower.The difference was statistically significant（P < 0.05）.Laser confocal microscopy showed that LC3 expression was higher and P62 expression was lower in RA-FLS.Conclusion：The relative expression levels of LC3 mRNA and protein in RA-FLS were significantly increased，while the relative expression levels of P62 mRNA and protein in RA-FLS were significantly decreased，suggesting that the level of macroautophagy was activated in RA，which may be the potential reason for the apoptosis resistance and proliferation activity of RA-FLS being significantly higher than those of OA-FLS.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;osteoarthritis;synovial fibroblasts;macroautophagy;LC3;P62

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）主要病理特征为滑膜增生、血管翳形成及软骨破坏，最终可致残疾和死亡。国内调查结果显示，RA等关节疾病和脑血管病是我国两大主要致残原因[1]。近年来，随着对本病认识的加深和新治疗方法的出现，其预后得到明显的改善，但总预后仍不容乐观，RA的发病机制至今仍未完全明确[2]。巨自噬过程在自身免疫性疾病中的作用逐渐成为研究热点，大量研究表明巨自噬在RA发病机制、病程进展中占有关键性地位[3]。类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）是一种以肿瘤样方式异常增殖的细胞，细胞活性增强，凋亡减少，导致滑膜异常增生，这在RA的发病机理中起关键作用[4]。巨自噬通过形成双膜囊泡（称为自噬体）而发生，是一个“自食”过程，该过程中有一系列自噬相关蛋白共同参与周密调控，此过程维持了细胞内环境的稳态平衡[5]。近年来，巨自噬在RA中发挥的作用受到广泛关注，有研究发现，巨自噬与RA的发病相关，并对其机制进行探索[6]。通常情况下，自噬是在应激条件下促进细胞存活的一种调节方式[7]。本研究检测巨自噬标志性因子P62、LC3在RA-FLS中的表达水平，初步探讨RA的发病机制。

1 实验材料

1.1 对象与资料 收集川北医学院附属医院骨科住院部RA患者的膝关节滑膜组织，培养原代RA-FLS。同时收集骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者的膝关节滑膜组织，分离、培养原代骨关节炎滑膜成纤维细胞（OA-FLS）作为对照。本研究获得川北医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试者均知情并同意参与。

1.2 主要仪器 倒置显微镜（上海OLYMPUS公司）;超微量紫外分光光度计（北京五洲东方科技发展有限公司）;全波长全自动酶标仪（瑞士Tecan公司）;LightCycler96实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）;凝胶成像系统（法国Vilber Lourmat公司）;脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 主要试剂 胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司）;青链霉素（美国Hyclone公司）;Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司）;MTT（上海碧云天生物科技有限公司）;PCR引物合成（生工生物工程上海股份有限公司）;RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟（北京索莱宝科技有限公司）;一抗稀释液（上海碧云天生物科技有限公司）;Trizol（美国Ambion公司）;逆转录试剂盒（德国QIAGEN公司）;脱脂奶粉（北京索莱宝科技有限公司）;PVDF膜（美国Cell Signaling Technology公司）;鼠抗人β-actin单克隆抗体（成都ZenBioScience公司）;兔抗人LC3单克隆抗体、兔抗人P62单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）;辣根过氧化物酶标记的兔抗、辣根过氧化物酶标记的鼠抗（成都ZenBioScience公司）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo Fisher公司）;FITC标记的兔抗、TRITC标记的兔抗（成都ZenBioScience公司）;Annexin V / FITC凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 原代细胞培养 RA与OA患者的滑膜组织取出后，立即放入无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中带入超净工作台，用无菌剪剪成1 mm3体积的小块，加入3倍体积4 mg·mL-1的Ⅱ型胶原酶，放入37 ℃孵箱中消化4 h，过200目无菌筛网，转移到25 cm2培养瓶中培养。取第3～7代较纯的RA-FLS与OA-FLS用于后续实验研究。

2.2 MTT法检测细胞活力 取对数生长期细胞RA-FLS与OA-FLS，消化离心后用完全培养基调整细胞悬液密度至2×104个·mL-1，每孔接种100 μL

于96孔板，时间梯度为1，2，3，4，5，6，7 d。另设空白对照组（无细胞组）扣除背景影响，每组设置6个复孔，四周用PBS补充，防止加样孔液体挥发过快导致差异;过夜待细胞贴壁成形后弃去原培养基，按时间梯度分别检测细胞的增殖活力，未检测孔每隔3 d换液1次;每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置孵箱中继续孵育4 h;弃液，每孔加入DMSO溶液150 μL，避光溶解10 min;用酶标仪测定各孔在570 nm波长处的吸光度（OD值）。细胞增殖活力（%）=[（给药组细胞OD值-空白组OD值）/（对照组细胞OD值-空白组OD值）]×100%。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期细胞RA-FLS与OA-FLS，消化离心后用完全培养基调整细胞悬液密度至1×105个·mL-1，接种于6孔板中，每孔2 mL。过夜待细胞贴壁，用PBS洗涤后收集细胞，加入标记荧光素AnnexinV-FITC 5 μL混匀后，加入PI染色试剂5 μL，混匀后室温避光反应5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 实时荧光定量PCR检测LC3、P62 mRNA的表达水平 细胞接种同2.3，用Trizol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度。根据RNA浓度检测的结果，将RNA逆转录成cDNA，根据试剂说明进行实时定量PCR反应。PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃反应5 s，60 ℃反应30 s，72 ℃反应20 s，40个循环。△△CT=△CT[CT（对照组目的基因）-CT（对照组内参基因）]-△CT[CT（实验组目的基因）-CT（实验组内参基因）]。内参β-actin和目的基因序列見表1。

2.5 Western Blot检测LC3、P62蛋白的表达水平 细胞接种及处理同2.3、2.4，用蛋白裂解液充分裂解细胞中的蛋白至少30 min，BSA法测定蛋白浓度，金属浴95 ℃变性蛋白10 min，然后进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，孵育一抗，孵育二抗，显影成像，结果用IMage J分析。

2.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 MTT检测结果 倒置显微镜下分别观察

RA-FLS与OA-FLS的细胞形态，原代滑膜细胞簇集生长，传至第3代后细胞较纯，分散式生长，均为长梭形，可见RA-FLS比OA-FLS更为细长。见图1。MTT结果显示，RA-FLS在1～3 d时生长速度最快，5～7 d基本达到增殖平衡，OA-FLS细胞生长速度明显低于RA-FLS。见图2。

3.2 流式细胞仪检测结果 流式细胞仪检测结果显示，RA-FLS组凋亡率为（6.4700±1.8474）%，OA-FLS组为（11.7500±1.3452）%，2组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3.3 RT-qPCR结果 RA-FLS与OA-FLS均存在LC3 mRNA、P62 mRNA的表达，RT-qPCR结果显示，RA-FLS组LC3 mRNA的相对表达量显著高于OA-FLS组（P < 0.05）;RA-FLS组P62 mRNA的相对表达量明显低于OA-FLS组（P < 0.05）。见表2。

3.4 Western Blot结果 RA-FLS与OA-FLS均存在LC3蛋白、P62蛋白的表达，Western Blot结果显示，RA-FLS组LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量明显低于OA-FLS组（P < 0.05）;RA-FLS组P62蛋白的相对表达量显著高于OA-FLS组（P < 0.05）。见表3。

3.5 激光共聚焦檢测结果 激光共聚焦检测结果显示，DAPI蓝色荧光代表细胞核，FITC绿色荧光代表LC3蛋白，TRITC红色荧光代表P62蛋白。与OA-FLS比较，RA-FLS中LC3绿色荧光斑点明显增多，P62红色荧光斑点减少，表明自噬途径被激活。见图3。

4 讨 论

位于滑膜内膜层的RA-FLS通过产生肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-8等细胞因子和有助于软骨破坏的蛋白酶在RA中起关键作用[8]。此外，RA-FLS参与了骨侵蚀性血管翳的形成和关节的血管新生，这些均与RA-FLS的快速增殖、凋亡减少密切相关[8]。不同RA患者的病情不同，经处理后的细胞株不足以说明RA患者体内的实际病理情况，以原代分离培养的

RA-FLS作为实验对象更具有代表性，本研究通过Ⅱ型胶原酶消化法成功从患者滑膜组织中培养原代滑膜细胞[9]。笔者首先通过MTT检测到RA-FLS的细胞增殖活力显著强于OA-FLS，这与SUN等[10-11]的研究结果一致，提示直接靶向RA-FLS是改善RA疾病进程的一种可靠思路。流式细胞仪检测结果表明，与OA-FLS相比，RA-FLS出现凋亡抵抗。

接着，本研究进一步发现，LC3、P62 mRNA的表达在RA-FLS中显著增加。LC3常被作为巨自噬的标志性因子，P62中LIR结构域负责识别并与自噬受体蛋白LC3结合，保证了巨自噬的正常进行。巨自噬是溶酶体吞噬和降解胞浆内含物的过程[12]。巨自噬的启动受Unc51样激酶1复合物的调控[13]，其中最关键的步骤是通过微管LC3与磷脂酰乙醇胺的缀合形成自噬体[14]。LC3被半胱氨酸蛋白酶Atg4裂解以产生胞质形式的LC3-Ⅰ，在被Atg7激活后，被转移到Atg3，以便与藻红蛋白的缀合物形式被改变，称为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是测试自噬活性的最常用标记[15]。进一步通过SDS-PAGE和免疫印迹分析后发现，在RA-FLS与OA-FLS中均检测到LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白，LC3-Ⅱ的数量与自噬小体的数量密切相关，可作为自噬小体形成的良好指标[16-17]，在RA-FLS中LC3-Ⅱ蛋白的相对表达明显多于OA-FLS，预示RA-FLS中自噬小体形成增多。自噬体形成后，通过将P62结合的泛素化底物掺入自噬体中，然后降解为自溶体，P62水平被自噬选择性降解，并作为自噬通量的读数[18]。因此，LC3-Ⅱ水平的增加、P62水平的降低反映了自噬的激活[19]。先前的报道还显示，RA或关节炎患者的FLS自噬增加，FLS自噬途径持续活化[20-22]。本研究显示，RA-FLS中P62 mRNA及蛋白相对表达水平均低于OA-FLS，自噬体形成增加和P62水平降低的组合提示RA中自噬激活;激光共聚焦结果同样表明，RA-FLS中LC3蛋白明显增多，P62蛋白明显减少，表明RA-FLS中自噬的激活可能是引起其凋亡减少、活性增强的重要因素之一。YANG等[23]也同样证明了RA-FLS中LC3-Ⅱ的表达上调以及P62表达的降低，表明RA中巨自噬的激活。

综上所述，RA-FLS中LC3 mRNA及蛋白的相对表达水平明显增高，P62 mRNA及蛋白的相对表达水平显著降低，提示RA中巨自噬水平活化，这可能是导致RA-FLS出现凋亡抵抗，增殖活性明显高于OA-FLS的潜在原因，从自噬着手治疗RA，控制滑膜组织异常增生可能是有效的方案。

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收稿日期：2020-09-14;修回日期：2020-10-30

基金項目：四川省卫计委项目基金（18ZD009）

作者单位：1.乐山市人民医院，四川 乐山 614000;2.川北医学院附属医院，四川 南充 637000

通信作者：刘福 四川省南充市顺庆区文化路63号，nslf91@163.com，13890760097