多花黄精炮制品与生品不同提取物抗运动疲劳作用的比较

杜小琴, 梁正杰, 夏 炎, 张小琴, 张万超, 韩金龙, 吴中宝*

多花黄精炮制品与生品不同提取物抗运动疲劳作用的比较

杜小琴1, 梁正杰1, 夏 炎1, 张小琴1, 张万超1, 韩金龙2, 吴中宝1*

(1. 重庆市药物种植研究所，特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，南川 408435；2. 山东省农业科学院农产品研究所，济南 250100)

对多花黄精炮制品与生品中多糖类成分、皂苷类成分、黄酮类成分的抗运动疲劳作用进行比较研究。随机将小鼠分为7组，即空白组、多花黄精炮制品组/生品多糖组、炮制品皂苷组/生品皂苷组及黄酮炮制品组/生品黄酮组，连续灌胃给药30 d后，测定小鼠负重游泳时间、耐缺氧时间、乳酸（LA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）活性、肝糖原含量和肌糖原含量。结果表明，多花黄精炮制品中多糖类成分为抗运动疲劳活性物质。多花黄精生品中多糖类成分、皂苷类成分为抗运动疲劳活性物质，其中多糖类成分在提高小鼠负重游泳时间、耐缺氧时间及肝糖原含量上极显著地高于空白组（＜0.01）。多花黄精炮制品、生品不同提取物与空白组相比，在血清LA含量、LDH活性及肌糖原含量上不具有统计学差异。多糖类成分为多花黄精主要的抗运动疲劳活性物质，生品中多糖类成分抗运动疲劳活性强于炮制品。

多花黄精；炮制品；生品；多糖；运动疲劳

黄精为百合科植物滇黄精Coll. et Hemsl.、黄精Red.或多花黄精Hua.的干燥根茎。多花黄精主产区为湖南、安徽等地[1]，重庆地区也有种植[2]。运动疲劳是指机体不能将它的功能保持在某一特定水平或不能维持某一预定的运动强度[3]，持续性或重度疲劳不仅会影响正常生活，还会导致内分泌紊乱、免疫力下降，甚至出现器质性疾病，威胁身体健康。《道藏神仙芝草经》记载：“黄精，宽中益气，肌肉充盛，骨体坚强，其力倍，多年不老”，即黄精具有强身健体功效。现代药理学研究表明，黄精中的多糖类成分可通过抗氧化性能清除自由基及减少机体由于疲劳引起的代谢产物堆积[4-5]，也可通过免疫调节发挥抗运动疲劳功效[6-7]，且毒副作用小。关于黄精其他成分的报道较少，对于黄精炮制品与生品不同提取物抗运动疲劳作用的对比研究也较少。有关黄精炮制与功效的关系，古代医家认为服用炮制黄精有保健功效，服用生品黄精有药用功效[1]。本文通过小鼠负重游泳实验、耐缺氧实验及相应生化指标的测定，对多花黄精炮制品与生品中多糖类成分、皂苷类成分、黄酮类成分提取物的抗运动疲劳作用进行了对比研究，以期为多花黄精抗疲劳产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄精源于湖南省安化金字山中药材专业合作社，经中药资源分类专家刘正宇鉴定为多花黄精（Hua.）；实验动物为昆明种小鼠，清洁级，雌雄兼用，体重18～22 g，北京斯贝福实验动物有限公司，合格证号为SCXK9（京）2016-0002；乳酸试剂盒和肝/肌糖原试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；Ⅱ型澄清剂 ZTC 1+1，武汉正天成生物科技有限公司；乙醇、氯仿、甲醇及正丁醇等均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 多花黄精的炮制 取黄精鲜品，去杂质后清洗，置于容器内，蒸煮、晾晒，重复6次，至内外呈滋润黑色，味甜无麻味时，切厚片，低温干燥。

1.2.2 多花黄精炮制品与生品中多糖类成分、皂苷类成分、黄酮类成分的提取、纯化

（1）多糖类成分的提取与纯化。

提取：取300 g净制后的0.5 cm×0.5 cm的块状黄精鲜品和100 g过65目筛的黄精炮制品，分别加入4倍重量的蒸馏水，回流提取2 h，收集滤液；加入2倍重量的蒸馏水回流提取1.5 h，重复1次；合并3次滤液，浓缩至300 mL。

澄清：澄清剂ZTC 1+1，分为 A液和B液。加入4%的B液，搅拌10 min后，再加入澄清剂2%A液，搅拌10 min，静置24 h后抽滤，将滤液浓缩至200 mL。

醇沉：加入600 mL无水乙醇，搅拌均匀后静置12 h，去上清液后，加入100 mL蒸馏水，搅拌均匀后加入400 mL无水乙醇，搅拌均匀后静置12 h，去上清液后减压干燥，得多花黄精炮制品/生品多糖类成分提取物。

含量测定：参照《中国药典》（2015版）中黄精多糖的含量测量方法，多花黄精炮制品多糖类成分的含量为70.21%，生品多糖类成分的含量为73.34%。

（2）皂苷类成分的提取与纯化。

提取：参照张英朔[8]的方法，稍有改动。取过65目筛的多花黄精炮制品/生品进行超声提取，其中乙醇浓度78%，料液比1:20 g·mL-1，超声温度58℃，超声时间75 min，分别重复3次，合并滤液，减压干燥。

纯化：将制备得到的含有黄精皂苷的粗提物通过硅胶色谱柱，洗脱液为氯仿-甲醇-正丁醇-水（10: 5:1: 4），纯化产物减压干燥后，得多花黄精炮制品/生品皂苷类成分提取物。

含量测定：参照张英朔[8]的方法，经测定多花黄精炮制品皂苷类成分的含量为61.03%，生品皂苷类成分的含量为60.65%。

（3）黄酮类成分的提取与纯化。

提取：取过65目筛的黄精炮制品/生品进行回流提取，其中乙醇浓度70%、提取温度70℃、料液比为1:20 g·mL-1、提取时间为2.5 h、提取次数为2次，合并提取液，作为黄精炮制品/生品黄酮类成分粗提液。

纯化：将该粗提液作为上样液，吸附于预处理好的AB-8大孔吸附树脂，其中样液pH值为6.0，吸附温度为25℃，吸附时间为8 h。待完全吸附后以去离子水洗脱，以95%乙醇解吸，收集解析液，减压干燥，得多花黄精炮制品/生品黄酮类成分提取物。

含量测定：参照刘清华等[9]的方法。经测定多花黄精炮制品黄酮类成分的含量为64.67%，生品黄酮类成分的含量为60.65%。

1.2.3 动物实验 选用210只昆明种小鼠，清洁级，雌雄兼用，体重18～22 g，适应性饲养1周。随机分为7组，每组30只，即空白组、黄精炮制品组/生品多糖组、黄精炮制品组/生品皂苷组、黄精炮制品组/生品黄酮组。各给药组均按照1.85 g·kg-1（药材/体重）给药，对照组给同体积的生理盐水，每天给药1次，小鼠连续给药30 d，测定各指标。

（1）负重游泳实验。每组随机取小鼠10只，雌雄各半，末次给药30 min后，将小鼠放入水槽中进行游泳试验，水深30 cm，水温 25℃±1℃，每只小鼠尾部负重为体重的 5%，记录每只小鼠游泳持续时间（自放入水中至头部不能浮出水面10 s的时间）。

（2）耐缺氧实验。每组随机取小鼠10只，雌雄各半，末次给药1 h 后，将小鼠同时分别放入250 mL 磨口瓶内（每瓶1只），其中每个瓶中放入10 g钠石灰，在瓶口处均匀涂上凡士林密封。从小鼠放入瓶中密封开始计时，记录小鼠在磨口瓶中存活的时间。

（3）乳酸脱氢酶(LDH)活力，乳酸(LA)、肌糖原和肝糖原含量测定。取每组剩余小鼠，末次给药30 min后，将小鼠置于水槽中进行游泳试验，水深30 cm，水温30℃±1℃，游泳90 min（不负重），游泳结束休息10 min后，将小鼠摘眼球取血，处死动物，立即取肌肉与肝脏。血液标本分离血清用于乳酸（LA）、乳酸脱氢酶(LDH)活力的测定；肌肉与肝脏置于0℃生理盐水中，剔除结缔组织，用滤纸吸干，研磨，匀浆，过滤，用于肌糖元、肝糖原含量检测，具体方法按试剂盒说明书进行。

1.3 数据处理

所有数据采用 SPSS 统计软件进行处理，以（`x±s）表示。以＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 多花黄精炮制品与生品中多糖类成分的抗运动疲劳效果比较

由表1可知，多花黄精炮制品、生品中的多糖类成分连续给药30 d后，小鼠的负重游泳时间分别为（14.42±1.77）和（14.87±2.02）min，显著长于空白组的（12.26±1.84）min（＜0.05）。生品中多糖类成分给药后的小鼠负重游泳时间比炮制品多3.1%，差异显著（＜0.05）；比空白组多21.3%，差异性达到极显著（＜0.01）。

多花黄精炮制品、生品中的多糖类成分连续给药后，小鼠的耐缺氧时间分别为（32.27±2.86）和（32.91±2.81）min，显著长于空白组的（30.05±2.46）min（＜0.05）。生品中多糖类成分给药后的小鼠耐缺氧时间比炮制组多2.0%，差异显著（＜0.05）；比空白组多9.5%，差异性达到极显著（＜0.01）。

多花黄精炮制品、生品中的多糖类成分连续给药后，小鼠的肝糖原含量分别为（14.49±1.65）和（14.88±1.57）mg·g-1，显著长于空白组的（12.61±1.69）mg·g-1（＜0.05），生品中多糖类成分给药后的小鼠肝糖原含量比炮制组多2.7%，差异显著（＜0.05）；比空白组多18.0%，差异性达到极显著（＜0.01）。

表1 多花黄精炮制品与生品中多糖类成分的抗运动疲劳效果比较

注：*和**分别为0.05及0.01水平上的显著性差异。下同。

表2 多花黄精炮制品与生品中皂苷类成分的抗运动疲劳效果比较

多花黄精炮制品、生品中的多糖类成分连续给药30 d后，与空白组相比，小鼠血清中的LA含量有一定降低、肌糖原含量及LDH活性有一定升高，但不具有统计学意义，两组之间差异也不显著（＞0.05）。

2.2 多花黄精炮制品与生品中皂苷类成分的抗运动疲劳效果比较

由表2可知，多花黄精生品中皂苷类成分给药30 d后，小鼠的负重游泳时间为（13.89±1.41）min，比空白组的（12.26±1.84）min多13.3%，差异达到显著（＜0.05）。炮制品中皂苷类成分给药后，小鼠的负重游泳时间与空白组、生品组相比，差异不显著（＞0.05）。

多花黄精炮制品、生品中的皂苷类成分连续给药30 d后，与空白组相比，小鼠的耐缺氧时间、LDH活性、肝糖原含量有一定的升高，肌糖原含量有一定的降低，但不具有统计学意义，两组之间差异也不显著（＞0.05）。

表3 多花黄精炮制品与生品中黄酮类成分的抗运动疲劳效果比较

表 4 多花黄精炮制品中多糖类、皂苷类、黄酮类成分的抗运动疲劳效果比较

表5 多花黄精生品中多糖类、皂苷类、黄酮类成分的抗运动疲劳效果比较

2.3 多花黄精炮制品与生品中黄酮类成分的抗运动疲劳效果比较

由表3可知，多花黄精炮制品、生品中黄酮类成分连续给药30 d后，与空白组相比，小鼠的负重游泳时间、耐缺氧时间、LDH活性、肝糖原含量、肌糖原含量均有一定的升高，肌糖原含量有一定的降低，但不具有统计学意义，两组之间差异也不显著。

2.4 多花黄精炮制品中多糖类、皂苷类、黄酮类成分的抗运动疲劳效果比较

由表4可知，多花黄精炮制品中多糖类成分连续给药30 d后，小鼠的负重游泳时间、耐缺氧时间及肝糖原含量显著高于皂苷类成分、黄酮类成分及空白组（＜0.05），但LA含量、LDH活性及肌糖原含量差异不显著（＞0.05）。与空白组相比，皂苷类成分、黄酮类成分给药后的小鼠负重游泳时间、耐缺氧时间、LA含量、LDH活性、肝糖原含量、肌糖原含量不具有统计学意义，两组之间差异也不显著（＞0.05）。

2.5 多花黄精生品中多糖类、皂苷类、黄酮类成分的抗运动疲劳效果比较

由表5可知，多花黄精生品中多糖类成分连续给药30 d后，小鼠的负重游泳时间比黄酮组多6.7%，比空白组多21.3%，差异均达到极显著（＜0.01）；小鼠的耐缺氧时间及肝糖原含量均极显著地高于黄酮类成分、皂苷类成分及空白组（＜0.01），但LA含量、LDH活性及肌糖原含量差异不显著（＞0.05）。皂苷类成分给药后的小鼠负重游泳时间显著高于空白组及黄酮组，差异显著（＜0.05），但耐缺氧时间、LA含量、LDH活性、肝糖原含量、肌糖原含量不具有统计学意义。与空白组相比，黄酮类成分给药后的小鼠负重游泳时间、耐缺氧时间、LA含量、LDH活性、肝糖原含量和肌糖原含量不具有统计学意义。

3 讨论与结论

黄精化学成分多样，主要有甾体皂苷类、黄酮类、苯丙素类、生物碱类、多糖等成分，其中多糖是黄精的主要化学成分之一，也是黄精药材及饮片法定质量控制成分。依据文献报道，黄精中抗疲劳的主要有效成分是黄精多糖，总黄酮和总皂苷也有一定作用，其他成分未见有抗疲劳作用的相关报道。本实验对多花黄精炮制品与生品中的多糖类成分、皂苷类成分、黄酮类成分进行了提取、纯化，含量测定结果表明主成分纯度均超过60%，多糖类成分中的其他成分为生物碱、维生素、微量元素、黏液质（在黄精上未见有抗疲劳作用的相关报道）等，而皂苷类成分、黄酮类成分中的其他成分可互相包含，但含量较低，对整体提取物的抗疲劳作用趋势及程度，影响较小。

（宋）唐慎微撰《证类本草》（1108年）记载：“黄精，补五劳七伤，助筋骨，止饥，耐寒暑，益脾胃，润心肺。单服九蒸九曝，食之驻颜，入药生用”。本实验发现多花黄精炮制品中多糖类成分在提高小鼠负重游泳时间、耐缺氧时间及肝糖原含量上的效果低于生品，这可能与多花黄精炮制品多糖类成分的含量低于生品有关。另外，本实验发现多花黄精生品中皂苷类成分在提高小鼠负重游泳时间上表现出抗运动疲劳活性，而炮制品与生品的黄酮类成分在本实验条件下均未表现出抗运动疲劳活性，说明皂苷类成分也可能为多花黄精的抗运动疲劳活性物质。

糖原是机体最重要的储能物质，肝糖原的主要作用是维持血糖的相对稳定，随着运动时间的延长，血糖水平开始下降，肝糖原分解作用增加。肌糖原不能直接分解成葡萄糖，须先分解产生乳酸，经血液循环到肝脏，再在肝脏内转变为肝糖原或合成为葡萄糖。本实验发现经30 d的连续给药后，与空白组相比，多花黄精炮制品与生品中多糖类成分提取物均可显著提高小鼠肝糖原含量（＜0.05），而对肌糖原含量的影响不具有统计学意义，说明小鼠负重游泳时间及抗缺氧时间的延长可能与肝糖原含量的提高有关，这与刘诗琼等[10]认为黄精多糖可提高肝糖原和肌糖原含量的研究结果不同，原因有待进一步研究。

LDH是糖酵解过程中一种重要的酶，促进丙酮酸氧化还原生成 LA，用于评价机体疲劳损伤后程度。当剧烈运动程度超过有氧运动时，氧气供应不足，糖类物质无氧呼吸产生大量乳酸，不能在短时间内进一步分解为水和二氧化碳，会引起血液及肌肉pH值的下降，从而产生疲劳[11-12]。本实验发现多花黄精炮制品与生品的多糖类成分、皂苷类成分、黄酮类成分在经30 d的连续给药后，与空白组相比，小鼠血清中LA含量、LDH活性未发生明显变化，这与陈靓雯等[13]认为古法炮制黄精多糖提取液可以降低游泳后小鼠血乳酸水平并加快其降解的研究结果不同，这可能与炮制方法的不同有关。

本实验通过小鼠负重游泳实验、耐缺氧实验以及对相应生化指标的测定，对比研究了多花黄精炮制品与生品中多糖类成分、皂苷类成分和黄酮类成分提取物的抗运动疲劳作用。结果表明多花黄精炮制品中多糖类成分为主要抗运动疲劳活性物质；生品中多糖类成分、皂苷类成分为主要抗运动疲劳活性物质，生品中多糖类成分的抗运动疲劳活性强于炮制品。

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Comparative study on anti-exercise fatigue effects of different extracts from raw materials ofHua and its processed products

DU Xiaoqin1, LIANG Zhengjie1, XIA Yan1, ZHANG Xiaoqin1, ZHANG Wanchao1, HAN Jinlong2, WU Zhongbao1

(1. Bio-resource Research and Utilization Joint Key Laboratory of Sichuan and Chongqing, Chongqing Institute of Medical Planting Material, Nanchuan 408435; 2. Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100)

The anti-exercise fatigue effects of polysaccharides, saponins and flavonoids of raw materials ofHua and its processed products were compared. The mice were randomly divided into 7 groups, i.e. the control group, polysaccharide group, saponin group and flavonoid group from raw materials ofHua and its processed products, respectively. After 30 days of continuous gavage, the mice were tested for swimming time under load, hypoxia tolerance time, lactic acid (LA) content, lactate dehydrogenase (LDH) activity, liver glycogen content and muscle glycogen content. The results indicated that polysaccharides in the processed products ofHua were the active substances against exercise fatigue. Polysaccharides and saponins from raw materials ofHua were the active substances against exercise fatigue, among which, polysaccharides were significantly higher than those in the control group in improving swimming time, hypoxia tolerance time and liver glycogen content (< 0.01). Compared with the control group, there were no statistically significant differences in LA content, LDH activity and muscle glycogen content. In conclusion, polysaccharides ofHua are the main active substances against exercise fatigue, which have stronger activity in raw materials than its processed products.

Hua; processed products; raw materials; polysaccharides; exercise fatigue

S567.099

A

1672-352X (2021)01-0026-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.015

2021-3-23 10:12:58

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210319.1543.030.html

2020-05-09

重庆市科技局项目（19KF10-2012），重庆市科技局技术创新与应用发展项目（cstc2019jscx-lyjsA0043）和山东省重点研发计划（鲁渝科技协作）项目（2019LYXZ022）共同资助。

杜小琴，助理研究员。E-mail：duxiaoqin1814@sina.com

吴中宝，副主任中药师。E-mail：wuzhognbao7788@sina.com