茶树根际土壤细菌多样性及其主要环境影响因子研究

贺屹成，王梦姣，秦公伟

陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000

茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我国重要经济作物，茶叶产业成为各主产茶区的支柱产业和部分贫困地区农民脱贫致富的重要产业。但在茶叶产业发展过程中，也出现了一些严重掣肘问题，如盲目使用化学肥料导致的茶园土壤土质退化、高剂量化学农药施用导致茶叶农药残留日益严重等。探索能显著降低化学肥料与农药施用量的新技术、新方法成为促进茶叶产业可持续发展的重要研究课题。

茶树根际土壤微环境的稳定性是茶树正常生长及茶叶品质的保证[1]，土壤微生物的多样性和稳定性还能促进恶劣土壤环境的生物修复[2]。 茶树根际土壤细菌，作为茶树根际土壤微环境中营养元素循环的重要驱动力，对土壤肥力和茶树正常生长具有显著促进作用[3]。例如，某些根际促生菌能够分泌生长素类物质促进植物生长[4]；某些具有较高固氮酶活性的菌株可以进行生物固氮，提供植物生长必需的氮元素[5]和提高土壤氮素含量[6]；根际促生微生物的旺盛代谢可以促进土壤有机物的分解和营养元素的矿化，改善土壤营养环境[7]，土壤营养元素的变化又会显著影响土壤根际微生物的群落组成[8]，从而形成一个良性循环。不仅如此，许多根际微生物通过分泌Phenazines 及其衍生物、Tropolone 和Pyocyunim 等抑菌物质[9-10]，达到预防和降低某些植物病害的效果。

试验从根际微环境出发，采用高通量扩增子测序法对茶树根际细菌的结构和功能进行研究，并结合茶树根际土壤营养元素含量、pH 值及含水量，分析土壤环境因素与根际细菌多样性的相互关系，以期为土壤改良和微生物菌肥开发提供理论基础和参考依据。

1 材料和方法

1.1 采样方法、采样地及茶树概况

采样点为秦巴山区的镇巴、宁强和城固三地的典型茶园（表1）。选择距离根系5 ～15 cm 的根周土壤，去除土壤表面异物后，取距离地表10 ～20 cm 深度的土壤样品；每处茶园不同树龄样品均按 “S”形补点，取10 份土壤样品[11]。收集土壤样品后迅速带回实验室进行充分混匀并过2 mm 筛，分装、标记后分别保存在4 ℃冰箱、-80 ℃冰箱。

表1 采样信息表Table 1 Sampling Information

1.2 茶树根际土壤理化指标测定

茶树根际土壤有机碳、总氮、总磷、全钾、水解性氨、有效磷、速效钾的含量测定分别参考森林土壤有机碳、氮、磷和钾的测定方法[12-15]。 土壤含水量及土壤pH值测定参考乔帅等[16]方法。

1.3 茶树根际土壤细菌多样性分析

采用高通量测序法测定分析茶树根际土壤细菌多样性，DNA 提取、PCR 扩增、产物电泳检测及切胶纯化、构建DNA 库、OTU 数据的获取及测序过程以及OUT 序列注释过程参考WANG 等[2]方法。

1.4 数据统计分析

1.4.1 系统进化树构建及多样性分析

选取总体相对丰度排在前50 且有属分类信息的OTU 代表性序列，构建系统发育树，系统发育树构建参考Saitou[17]。

使用QIIME（V1.9.1） 软件中的alpha_diversity. py 脚本对OTU 序列进行分析，并计算α 多样性指数（Chao1、Shannon 以及Simpson）。

利用非度量多维尺度法（Nonmetric Multi-Dimensional Scaling, NMDS）计算样品的Weighted Unifrac 和Uweighted Unifrac 距离，分析其β 多样性。

1.4.2 NMDS（Non-metric Multidimensional scaling） 分析

在beta 多 样 性 距 离（Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac）的计算基础上，基于Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距离矩阵，使用QIIME 软件和ggplot 2 软件包进行NMDS 分析并绘制出NMDS 图。

1.4.3 茶树根际理化指标分析

茶树根际土壤元素含量、酸碱度和含水量取3 次平行实验平均值，用SPSS 和R 软件，计算不同采样地之间物理化学指标的平均值、方差及其之间的差异性，p ＜ 0.01 表示组别之间差异性显著，用小写字母标明。

1.4.4 相关性分析

RDA/CCA 分析：使用R 软件对环境因子进行DCA（Detrended correspondence analysis）分析，根据梯度值确定模型类型，并分析绘图。

分别用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）和R 软件，进行环境因子与高通量测序结果中细菌α 多样性指数及相对丰度大于1%的门的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 茶树根际土壤细菌群落结构和多样性

2.1.1 茶树根际土壤细菌群落结构

高通量测序结果表明，三个茶园土样中细菌分布在41 个门中，其中相对丰度大于1%的有13 个门（图1A），变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门为优势菌门。变形菌门所占百分比在镇巴及城固土样中随茶树树龄增长先下降后增高，在宁强土样中先升高后下降；酸杆菌门所占百分比在镇巴及城固土样中随茶树树龄增长先上升后下降，在宁强土样中则持续上升；拟杆菌门所占百分比在三个采样地均随茶树树龄增长而持续下降。

三个茶园茶树根际细菌分布于1288 个属中，其中相对丰度占比大于1%的属有33 个（图1B）。地杆菌属（16.54%）为镇巴2 年树龄茶树根际细菌的优势属,代尔夫特氏属（8.31%）为城固20 年以上树龄茶树根际细菌的优势属。

选取所有采样地不同树龄根际土壤中总体相对丰度排在前50 且有属分类信息的OUT 代表性序列构建系统发育树（图1C），并将其相对丰度进行可视化展示。结果表明，Delftia OTU3 是总体相对丰度最高的序列。

1 ～ 34 分别代表相对丰度小于1%及未鉴定种等的总和、Bryobacter、Solibacter、RB41、嗜酸栖热菌属、Parafrigoribacterium、Paeniglutamicibacter、 黄杆菌属、地杆菌属、芽孢八叠球菌属、芽单胞菌属、硝化螺菌属、伯克氏菌属、反硝化卡斯特兰尼氏属、代尔夫特氏属、Massilia、Chujaibacter、 Rhodanobacter、寡养单胞菌属、Udaeobacter、Chthoniobacter、Granulicella、Koribacter、Mucilaginibacter、HSB_OF53-F07、慢生根瘤菌属、 贪嗜菌属、Acidipila、Lysobacter、假单胞菌属、 Haliangium、Pseudolabrys、Acidibacter、Terrimonas。

2.1.2 茶树根际土壤细菌多样性

土壤样品中细菌α 多样性指数结果（图2A）表明，三个采样地不同树龄物种数量变化趋势不完全一致，镇巴采样地10 年树龄茶树根际细菌数量最多；城固和宁强采样地不同树龄茶树根际细菌数量有一定变化，但是变化不显著。香农指数和辛普森指数结果表明（图2B、图2C），三个采样地不同树龄茶树根际细菌多样性变化不一致，镇巴采样地2 年树龄茶树根际细菌多样性最差，城固采样地10 年树龄茶树根际细菌多样性最差，宁强采样地20 年以上树龄茶树根际细菌多样性最差。

采用NMDS 法对样品的Beta 多样性进行分析，结果表明（图3），树龄越大，样品之间根际细菌群落多样性差异越小，不同采样地20 年以上树龄茶树根际样品的细菌多样性差异最小。

图1 三地茶园茶树根际土壤细菌群落组成分析Figure 1 Analysis of bacterial community composition in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

图2 三地茶园茶树根际土壤细菌Alpha 多样性分析 Figure 2 Analysis of α-bacterial diversity in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

图3 利用非度量多维尺度法三地茶园茶树根际土壤细菌Beta 多样性分析 Figure 3 Analysis of Beta-bacterial diversity in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens by nonmetric multidimensional scaling method

2.2 茶树根际土壤理化性质

茶树根际土壤元素含量分析结果（图4）表明，镇巴和城固两地茶树根际土壤的有机碳、总氮、水解性氮、有效磷以及速效磷等元素含量都随树龄增加而呈现下降的趋势，个别元素含量在20 年以上树龄的茶树根际土壤中略有上升（图4A、图4B、图4E、图4F、图4G）。宁强采样地10 年树龄茶树根际土壤中有机碳、总氮、水解性氮及有效磷等元素含量均为最高（图4A、图4B、图4E、图4G）；2 年树龄茶树根际土壤中总磷含量、有效磷含量及全钾含量均为最高（图4C、图4D、图4F）。

三地不同树龄土壤样品pH 值无显著差异性（图4H）。土壤含水量呈现出不同变化趋势，含水量最高的分别是镇巴采样地10 年树龄茶树根际土壤、城固2 年树龄茶树根际土壤及宁强20 年以上树龄茶树根际土壤（图4I）。

图 4 茶树根际土壤元素含量、pH 值及含水量（数据差异性标注同图1 和图2）Figure 4 Analysis of element content, pH value and water content in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

2.3 根际土壤理化性质与细菌多样性的相关性

采用RDA/CCA 方法对土壤理化性质与细菌多样性进行相关性分析，结果（图5）表明，对采样地根际微生物多样性影响最大的前四位环境因子分别为土壤总氮含量、pH 值、有机碳及水解性氮。

对环境因子与细菌多样性指数及13 个主要细菌门相关性分析结果表明，有机碳、总氮和水解氮与chao1 和shaanon 指数呈极显著或显著负相关，但是对simpson 指数相关性不显著；土壤pH 值与simpson 指数显著相关（表2）。有机碳、总氮、水解性氮、速效钾含量与各细菌门相关性显著或极显著，其余环境因子与细菌门的显著或极显著相关数量均远小于50%；醋酸杆菌门、放线菌门、Patescibacteria 的相对丰度受到环境因子影响大（表3）。

图5 RDA/CCA 法分析细菌多样性与环境因子关系Figure 5 Relationship between bacterial diversity and environmental factors analyzed by RDA/CCA method

表2 环境因子与根际土壤细菌α 多样性指数相关性Table 2 Correlation between environmental factors and Alpha diversity index of rhizosphere soil bacteria

表3 环境因子与根际土壤细菌门的相关性Table 3 Correlation between environmental factors and microbial phylum in rhizosphere soil

3 结论与讨论

本研究采用高通量测序法对秦巴山区镇巴、宁强和城固三地的典型茶园中不同树龄根际土壤细菌多样性进行分析，共检测到13 个主要的细菌门（门的相对丰度大于1%），这些主要细菌门在每个采样地分布总丰度范围为80.25%～98.95%；变形菌门、酸杆菌门以及拟杆菌门为优势菌门。这一结果与前人研究[18]相比，分离得到的门的种类多，优势菌门占比低，充分反映了样地茶树根际土壤细菌多样性较为丰度。伯克氏菌、慢生根瘤菌、Chthoniobacter, Flavobacterium, Gemmatimonas, Massilia 以及 RB41 都是常见的根际促生菌[19]，这些菌都能在本研究中找到，说明本研究样品采集地具有开发根际促生微生物的可能性。

不同树龄茶树根际土壤细菌多样性变化趋势表明，镇巴2 年生树龄茶树根际土壤细菌丰富度最低，城固则为10 年树龄、宁强20 年树龄的茶树根际土壤细菌丰度最低。值得注意的是，虽然不同采样地细菌丰富度指数变化趋势不一致，但是除去组中丰富度最低的树龄，本组中剩余两个年份树龄茶树根际细菌丰富度变化不显著。因此，一方面可以得出，以上变化趋势可能和采样地细菌数量有一定关联；另一方面也说明，受到细菌数量的影响，在判断具体哪个采样地、哪个树龄茶树根际细菌多样性丰度最佳，还需继续深入研究。

对样品的Beta 多样性分析结果表明，树龄越长，茶树根际土壤细菌结构组成越相似。但是不同地区不同树龄的根际土壤细菌多样性变化不完全一致，这可能是不同地区根际土壤性质有一定差别，如营养元素含量、胶体结构、土壤性质、土壤颗粒度等，对细菌多样性有一定影响[20]。因长期施肥和茶树根部有机酸的分泌，树龄较大的茶树根际土壤会出现明显的土壤酸化、板结、正常土壤团粒被破坏等现象，导致茶树根系延展困难，吸收功能降低，茶树长势逐渐减弱，分泌物逐渐降低，与根际微生物互作显著下降[21]。细菌是土壤微生物，尤其是根际微生物中的主要种群，但是大多数细菌的最适酸碱度是中性或中性偏碱性，酸性土壤也不适合大部分细菌生存。综合分析，本研究认为，在进行后续秦巴山区典型茶树根际土壤微环境与茶树互作，尤其是根际土壤细菌多样性与茶树的相互关系研究中，建议将10 年树龄茶树根际土壤作为研究对象。

本研究对土壤环境因子与茶树根际微生物的相关性研究结果表明，土壤有机碳含量、总氮含量、水解性氮含量能够显著影响茶树根际土壤细菌多样性，pH 值与速效钾与茶树根际土壤细菌多样性有一定影响，与O'Brien 和Pasternak 的结果较为一致[22-23]。