白藜芦醇通过调控CTRP6对高血压大鼠心肌纤维化的影响*

黄文祺，蔡峥，周华

(上海中医药大学附属曙光医院 老年病科，上海 201203)

心肌纤维化是长期高血压导致的一种心肌组织病理学改变，心肌细胞肥大、心肌成纤维细胞的过度增殖以及胶原的大量沉积是高血压心肌纤维化的主要病理特征[1]。既往研究发现，腹主动脉缩窄术(constriction of abdominal aorta，AAC)是诱导高血压大鼠的一种经典的模型[2]。基础和临床资料证实，高血压进程中会出现心肌僵硬增加，导致心肌活动受限，心室顺应性降低，最终诱发心肌的收缩与舒张功能的异常[3-5]。以上临床表现与心肌纤维化的进展密切相关，严重者可以导致高血压心脏病损害。因此，积极寻找有效的药物对治疗高血压心肌纤维化十分重要。白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种存在葡萄皮、浆果等多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化以及抗纤维化等作用[6]。研究表明，RES能够通过下调TGF-β1/Smads信号通路抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖和分化，减轻心肌纤维化程度[7]。在阿奇霉素诱导的大鼠心肌纤维化模型中，RES能够上调沉默信息调节因子3(sirtuin 3，SIRT3)降低阿奇霉素诱导的氧化应激水平、抑制心肌组织炎症细胞因子表达进而提高抗心肌纤维化能力[8]。以上研究表明，在多种心肌纤维化模型中RES能够有效的抑制心肌纤维化进程，改善心肌功能。但是有关RES对ACC诱导的高血压心肌纤维化的作用机制尚不完全清楚。因此，本研究拟通过构建高血压心肌纤维化动物模型，探究RES对心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 雄性、无特定病原体(specific pathogen free，SPF)感染、周龄6～8周以及体质量(body weight，BW)为(200±20)g的斯泼累格·多雷(sprague dawley，SD)大鼠购买于中南大学湘雅医学院动物学部[SCXK(湘)2017-0011]，适应性喂养1周。饲养条件：昼夜交替，温度25 ℃，相对湿度70%。

1.1.2药品与试剂 RES(批号R5010-100MG，美国sigma公司，纯度≥99%)、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，货号C0105S)、马松(Masson)染色试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，货号C0110)、胶原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)抗体(Abcam公司，货号ab7778)、转化生长因子β1(TGF-β1)抗体(Abcam公司，货号ab215715)、C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)抗体(Abcam公司，货号ab36900)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(江苏碧云天生物技术公司，货号AF5009)、小鼠二抗(江苏碧云天生物技术公司，货号A0286)、兔二抗(江苏碧云天生物技术公司，货号A0277)、一抗和二抗稀释液(江苏碧云天生物技术公司，货号P0025S)以及极超敏ECL发光试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，货号P0018S)。

1.1.3主要仪器 G22-W型高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)、SuPerMax 3000FA型多功能酶标仪(Thermo赛默飞世尔)、M371450型组织涡旋仪(武汉维塞尔生物科技有限公司)、TC-XDS-500C型荧光倒置显微镜(日本/奥林巴斯Olympus)、Western blotting检测装置(美国Bio-Rad伯乐公司)以及GoodLook-1000型成像系统(美国Bio-Rad伯乐公司)。

1.2 方法

1.2.1模型构建与分组 30只SD大鼠随机 分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)和RES治疗组(RES组)。其中Model组采用ACC法构建大鼠高血压心肌纤维化。造模按照3 mL/kg剂量腹腔注射水合氯醛(100 g/L)麻醉大鼠、腹中线周围皮肤消毒，沿腹中线纵向切开皮肤，分离皮下组织，暴露腹主动脉；Model组和RES组在有肾动脉分支约0.5 cm处按照文献[9]方法进行ACC术，Sham组仅穿线不结扎。在造模成功之后，RES组给予剂量为10 mg/(kg·d)的RES灌胃7 d，Model组和sham组给予等量的生理盐水灌胃7 d。

1.2.2尾动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)和左心室体质量指数(left ventricular mass index，LVMI)测定 造模28 d后，尾套法测定SBP，电子称称量大鼠BW，打开大鼠胸腔取出心脏，并分离左心室称重(left ventricular mass，LVM)，计算LVMI=LVM/BW。

1.2.3HE染色检测心肌形态、Masson染色观察心肌纤维 采用4%的多聚甲醛固定各组大鼠心尖组织，石蜡切片，并按照HE染色试剂盒进行心尖组织染色。按照Masson染色试剂盒步骤进行心尖间质胶原染色，染色后肌纤维呈现红色，胶原纤维呈现蓝色。

1.2.4Western blot检测心尖组织Collagen Ⅲ、TGF-β1和CTRP6蛋白表达 取各组大鼠的心尖组织放置于组织研磨管内，按照1 ∶4的比例加入组织裂解液并放置于冰上裂解40 min，期间每间隔5 min进行组织涡旋振荡保证裂解完全，将裂解后的离心管放置于离心机内，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，得到组织上清液。二辛喹酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白质浓度，按照35 μg/孔上样，电泳，转膜，孵育Collagen Ⅲ一抗(1 ∶1 000)、TGF-β1一抗(1 ∶1 000)以及CTRP6一抗(1 ∶500)4 ℃过夜，洗膜，孵育对应的二抗室温孵育60 min，TBST洗膜5 min×3次，加入显影液，显影并拍照。图片扫描后用Image J 软件计算各条带的灰度值，并以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RES对高血压大鼠心肌结构的影响

3组大鼠BW比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与sham组相比，Model组SBP和LVMI明显升高(P<0.01)；与Model组相比，RES组SBP和LVMI降低(P<0.05或P<0.01)。HE染色显示，Sham组大鼠心肌组织结构正常，心肌纤维排列规则；Model组大鼠心肌组织结构紊乱，心肌纤维排列不规则，有明显水肿现象；RES组大鼠心肌纤维排列相对规则，有少许水肿现象。见图1、表1。

表1 各组大鼠BW、SBP和LVMI比较 Tab.1 Measurement results of BW,SBP,and LVMI of rats in each group

注：箭头表示心肌水肿。图1 观察3组大鼠心肌形态变化(HE,×200)Fig.1 The morphological changes of rat myocardium in three groups(HE,×200)

2.2 RES对高血压大鼠心肌纤维化的影响

与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织间质有大量胶原沉积；与Model组相比，RES组大鼠心肌间质胶原沉积减少。Western blot检测显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织Collagen Ⅲ和TGF-β1表达显著升高(P<0.01);与Model组相比，RES组大鼠心肌组织Collagen Ⅲ和TGF-β1表达降低(P<0.05或P<0.01)。见图2、图3。

注：箭头表示心肌胶原沉积。图2 3组大鼠心肌纤维化情况(Masson,×200)Fig.2 Masson staining to observe myocardial fibrosis in each group of rats(Masson,×200)

注：(1)与sham组相比，P<0.01；与Model组相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01。图3 各组大鼠Collagen Ⅲ和TGF-β1蛋白表达Fig.3 Collagen Ⅲ and TGF-β1 protein expression in each group of rats

2.3 RES对CTRP6蛋白表达的影响

结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心尖组织CTRP6表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与Model组相比，RES组大鼠心尖组织CTRP6表达显著升高差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：(1)与sham组相比，P<0.01；(2)与Model组相比，P<0.05。图4 各组大鼠CTRP6蛋白表达Fig.4 CTRP6 protein expression in each group of rats

3 讨论

RES是一种从中药材提取出来的抗毒素，近年来有关RES在心血管疾病中发挥重要作用。基础和临床研究资料表明，RES能够降低心肌氧化应激水平，抑制细胞凋亡和炎症反应进而改善高血压合并心肌纤维化[10-13]。本研究首先通过ACC复制高血压大鼠模型，与Sham组比较，ACC复制模型组SBP和LVMI均显著升高，表明高血压大鼠模型建立成功。为探究RES对高血压大鼠的影响，RES组大鼠给予剂量为10 mg/(kg·d)的RES灌胃7 d。结果显示，与Model组相比，RES能够有效降低SBP和LVMI。心肌纤维化是高血压合并心脏病的重要病理学改变，通过有效抑制心肌纤维化对降低高血压心脏病具有重要意义。既往研究发现，吡格列酮可以通过调节基质金属蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)/基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)平衡促进胶原降解，进而抑制胶原沉积和心肌纤维化进程，其作用机制可能与抑制心肌组织活性氧产生相关[10]。另外，淫羊藿次苷Ⅱ能够下调MMP-2、MMP-9和TIMP-1，改善自发性高血压大鼠心肌的纤维化情况[14]。RES能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心脏成纤维细胞胶原的合成，其机制可能与降低Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及TGF-β1的蛋白表达相关[15]。本研究发现，Model组大鼠心肌组织结构紊乱，心肌纤维排列不规则，有明显水肿现象。RES组大鼠心肌纤维排列相对规则，有少许水肿现象。Masson染色显示，与Model组相比，RES组大鼠心肌间质胶原沉积减少。进一步研究，Model组大鼠给予RES灌胃处理7 d后，心肌组织Collagen Ⅲ和TGF-β1表达均显著降低。以上研究结果表明，RES能够抗ACC诱导的高血压大鼠心肌纤维化。但是，目前有关RES对高血压心肌纤维化的作用机制尚不完全清楚。

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(C1/qtumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)是一种脂肪因子蛋白超家族成员之一，在胎盘、肾脏、心脏等组织中广泛表达[16-18]。有研究报道，CTRP6与多种疾病状态的炎症反应与纤维化密切相关[19-22]。新近研究证实，在大鼠心肌梗死模型中，心肌组织CTRP6表达显著降低，过表达CTRP6能够抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[23]。在糖尿病心肌病大鼠模型中心肌组织CTRP6表达显著降低，在给予阿司匹林灌胃后心肌组织CTRP6表达显著升高，心肌纤维化程度得到明显改善[24]。以上研究表明，CTRP6能够抑制心肌纤维化过程，发挥心肌保护作用。为此，本研究探究RES能否通过CTRP6抑制高血压大鼠心肌纤维化。与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织CTRP6表达显著降低。在给予RES灌胃处理7 d后心肌组织CTR6表达显著升高。以上结果初步证实，RES对高血压心肌纤维化的保护作用可能与促进CTRP6表达有关。

综上所述，本研究通过探究RES对ACC诱导的高血压大鼠模型，发现RES能够抗高血压心肌纤维化，其作用机制可能与上调CTRP6表达相关，但是有关CTRP6在RES抑制高血压心肌纤维化的具体分子机制需要进一步探究。因此，在后续研究中将通过过表达或敲除CTRP6细胞和动物的实验验证RES对其调控的机制。