荭草提取物对异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌缺血的作用及机制*

孙佳，潘洁，秦兰,，杨淑婷,，刘春花，徐兴莲，王永林，陆苑**

(1.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室 &省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

荭草为蓼科植物荭草(PolygonumorientaleL.)的干燥果穗及带叶茎枝，性平、味辛，归肝脾经，具有祛风除湿和活血消肿的功效，用于治疗风湿性关节炎、冠心病、疝气及疮肿等，收载于2003版《贵州省中药、民族药质量标准》中，荭草在贵州省分布广泛，为民间常用于缓解胸痛、胸闷及气短等急性心肌缺血症状的治疗[1-3]。国内外研究报道表明，荭草药材中含有黄酮类、木质素类、甾体皂苷类及二苯乙烯类等化学成分，现代药理研究表明其具有抗心肌缺血和抗缺氧、增加心肌营养血流量、保护梗死心肌、抗血栓、抗氧化及抗菌等多种药理活性[4-7]。本课题组前期已开展荭草药用部位的筛选和化学成分研究，确定了荭草的有效部位为水煮醇沉、正丁醇萃取80%乙醇洗脱段，其含量较高的主要活性成分为黄酮类化合物，如荭草素、异荭草素及牡荆素等[8-9]，并明确了其在细胞水平上对体外H9C2细胞有抗氧化作用[10]。心肌缺血(myocardial Ischemia，MI)是指冠状动脉的供血不能满足心肌耗氧量的需求，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常的一种病理综合征[11-13]。缺血性心脏病或突发性心脏病是世界范围内最常见的致死和致残的单一因素，MI为冠心病、心绞痛及心肌梗死等多种疾病的共同病理生理机制[14-17]。研究表明，大剂量异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO) 可因增加心肌耗氧而造成大鼠急性MI，其主要机制是通过强烈收缩冠状动脉，造成心肌组织急性供血不足，并能增加外周阻力和心脏负荷，其心电图、心肌酶学及组织病理学变化均类似于人类MI致急性心肌梗死的病变特征[18-20]。因此本研究选择ISO诱导的大鼠急性MI为模型，通过观察不同时间荭草提取物对急性MI大鼠的心电图、血清酶学指标及心肌组织形态学的影响，探讨荭草对MI损伤的作用、药物起效时间及其作用机制，为荭草产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级Sprague Dawley (SD)大鼠30只，雄性，体质量为(250±20)g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供[动物许可证号SCXK(渝)2012-0008]。

1.1.2主要药品与试剂 荭草药材购买自贵州省六盘水，由贵州医科大学刘春花副教授鉴定为蓼科植物荭草的干燥全草，标本存于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，荭草提取物由该室提取制备。复方丹参片(广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号G17A007)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及磷酸肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，盐酸ISO(上海禾丰制药有限公司，批号100203)，水合氯醛(纯度≥0.99，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.1.3主要仪器 四通道生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司)，680型酶标仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)，Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)，微量移液器(德国Eppendorf股份公司)，超低温冰箱和MD-100自动生化分析仪(美国 Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1动物造模和分组 30只SD大鼠适应性喂养1周，随机均分为正常组、模型组、阳性药复方丹参片对照组(1 g/kg，阳性对照组)、荭草提取物低剂量组(3.2 g/kg，荭草低剂量组)及荭草提取物高剂量组(6.4 g/kg，荭草高剂量组)；除正常组外，其他各组大鼠分别以50 mg/kg剂量皮下注射ISO生理盐水，1次/d，连续注射2 d制备急性MI大鼠模型；正常组大鼠注射等体积的生理盐水。造模完成后，荭草低、高剂量组和阳性对照组均给予相应治疗药物灌胃，2次/d，连续3 d；模型组和空白对照组大鼠灌胃等体积蒸馏水(15 mL/kg)。

1.2.2心肌电生理指标测定 各组大鼠末次给药后，腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，用针状电极插入左下肢、左上肢和右上肢连续监测标准Ⅱ导联心电图，进行心电监护，观察给药后0.5、2.0及6.0 h时各组大鼠的心电图(electrocardiogram，ECG)变化，测量ST段的偏移程度。

1.2.3血清酶学指标 各组大鼠于末次给药后0.5、2.0及6.0 h，经尾静脉取血约1 mL置塑料离心管中，4 ℃静置2 h，4 ℃、3 000 r/ min离心 10 min，吸取上层血清，按照相关试剂盒说明书操作，用MD-100自动生化分析仪检测血清中LDH、SOD及CK-MB水平。

1.2.4组织形态学指标 各组大鼠于末次取血结束后，取出心脏、洗净血液、立即放入含20倍组织体积的4%多聚甲醛溶液中固定，16～24 h后脱水、包埋及制作5 μm石蜡切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光学显微镜下观察心肌组织病理学改变。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ECG ST段的变化

与正常组相比，MI模型组大鼠ECG ST段明显抬高(P<0.01)；与模型组比较，荭草低、高剂量组大鼠ECG ST段均降低(P<0.05或P<0.01)；阳性对照组的大鼠ECG ST段与模型组相比，亦明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠ECG 不同时点ST段变化Tab.1 Changes of ST segment in ECG of rats in each group at different time points

2.2 血清SOD

与正常组相比，模型组大鼠血清SOD水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，荭草低、高剂量组大鼠血清SOD水平升高(P<0.05)，但给药后各时间点血清SOD水平升高程度无差异(P>0.05)；阳性对照组的大鼠血清SOD水平与模型组相比亦升高(P<0.01)，且给药后各时间点血清SOD水平也无差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时点血清SOD水平Tab.2 Changes of SOD content in serum of rats in each group at different time points

2.3 血清LDH

与正常组相比，模型组大鼠血清LDH明显升高(P<0.01)；与模型组比较，荭草低、高剂量组大鼠血清LDH明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)，且给药后2.0 h血清LDH水平低于0.5和6.0 h的血清LDH水平，但差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组的大鼠血清中LDH水平与模型组相比亦明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)，且给药后2 .0 h的血清LDH水平低于0.5和6.0 h的血清LDH水平，但差异无统计学意义(P>0.05)，各时间点LDH降低程度与荭草提取物各组较一致。见表3。

表3 各组大鼠不同时点血清LDH水平Tab.3 Changes of LDH content in serum of rats in different groups at different time points

2.4 血清CK-MB

与正常组相比，模型组大鼠血清CK-MB明显升高(P<0.01)；与模型组比较，荭草低、高剂量组大鼠血清中CK-MB降低(P<0.05)，且降低程度随时间的增加而减小；阳性药对照组的大鼠血清中CK-MB与模型组相比亦降低(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠不同时点血清CK-MB水平Tab.4 Changes of CK-MB content in serum of rats in different groups at different time points

2.5 心肌组织组织学

正常组大鼠心肌细胞形态正常，胞质，胞核清晰，肌纤维排列整齐有序。模型组大鼠心肌细胞出现变性坏死和出血，肌纤维排列紊乱，可见大量炎性细胞浸润，成纤维细胞轻度增生及血管增生充血。用药各组大鼠心肌细胞病变较模型组减轻，其中阳性对照组组大鼠大部分心肌纤维排列整齐，细胞间隙水肿减轻，成纤维细胞增多间质内偶见部分炎性细胞浸润；荭草低剂量组大鼠大部分心肌纤维排列整齐，肌束间隔略增宽，细胞间隙水肿减轻，间质内偶见部分炎性细胞浸润及灶性心肌出血；荭草高剂量组大鼠心肌纤维轻度排列紊乱，轻中度空泡样变性，肌束间隔中度增宽，轻度水肿，间质少量炎性细胞浸润及灶性心肌变性和出血。见图1。

正常组 模型组 阳性对照组 荭草低剂量组 荭草高剂量组图1 各组大鼠心肌组织的病理形态学特征(HE，×100)Fig.1 The pathomorphological characteristics of myocardial tissues of rats in each group(HE，×100)

3 讨论

本研究采用ISO皮下注射的方法诱导大鼠急性MI，异丙肾上腺素是经典的β1、β2受体激动药，其能够兴奋心脏的β1受体，能够通过收缩冠状动脉、使心率加快及传导加速，从而妨碍冠状动脉血灌注流量造成心肌耗氧量增加，心脏负荷过重，心肌微循环障碍，冠状动脉痉挛，心肌梗死样变，引起MI[21-22]。ECG 是缺血心肌变化的敏感指标，当大鼠心肌产生心肌损伤及坏死时，会出现ECG ST段的异常改变，所以MIST段的变化幅度可基本反映MI的严重程度，因此ST段的偏移可作为缺血程度的定量指标[23]。本实验结果可见，荭草提取物组可显著降低由于急性MI所致的大鼠ECG ST段的抬高，且效果随着给药后时间的增加而增大，说明荭草提取物可有效改善大鼠MI后导致的ECG 异常改变，且作用效果较强且持久。

当MI产生时，细胞膜通透性增加，细胞内酶大量释放入血液，而血清中心肌酶CK-MB、LDH等的高低可反映缺血心肌的损伤程度[24]，其中 CK-MB是磷酸肌酸激酶CK的4种同工酶之一，95%的CK-MB存在于心肌细胞质中，能催化肌酸和腺苷三磷酸生成磷酸肌酸和腺苷二磷酸，该可逆性反应所产生的磷酸肌酸含高能键，是肌肉收缩能量的直接来源[25-26]；CK-MB释放数量的变化与心肌损伤程度呈正相关，是反映心肌损伤最敏感的指标之一[27]。LDH 是糖酵解途径中的重要酶，位于细胞质，广泛分布于各组织中，心肌居第2位[28-29]。当MI、心肌细胞损伤及细胞膜破坏时，即使少量心肌组织损伤或坏死所释放的酶，都足以引起血清中该酶活性的升高[17]，故其活性是反映MI损伤的重要指标之一。当MI缺氧时，由于产生大量的过氧化物，导致SOD大量消耗，使其活力降低，所以通过检测SOD活性可以评估组织内自由基代谢情况及MI程度[30]。

本研究结果显示，与模型组相比，荭草提取物降低了MI所致的ECG ST段抬高，减少了CK-MB和LDH的释放，提高了血清SOD活性，因此提示对急性MI具有明显的保护作用，其作用机制可能与保护心肌细胞功能、提高心肌抗氧化能力、清除氧自由基有关。通过观察不同时间点的药效结果，可见模型大鼠给药0.5 h就有显著的治疗效果，说明荭草提取物具有起效迅速的优点。同时，研究显示大鼠血清中SOD活性和CK-MB随着时间延长而逐渐升高、LDH先降低后升高，产生该现象的原因可能与上述药效指标相关的化合物在体内的吸收、分布、代谢和排泄(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)过程改变有关。从剂量上看，低剂量组大鼠药效比高剂量组更好，高剂量组心肌组织病理切片可见组织空泡化，可能是因为高剂量组的荭草提取物用量超过了它本身正常的量效关系。

综上所述，通过ISO致急性MI模型，大鼠出现典型的MI现象，同时血液中LDH和CK-MB升高，SOD降低，表示造模成功；而荭草提取物低、高剂量组均能改善MI的状态，药效实验数据显示，低剂量组药效最好，本研究初步阐明了荭草提取物对MI损伤具有保护作用。