黄酮类中药抗细菌溶血素研究进展

贺尚文，侯思鲁，李秋月，张 慧，徐媛媛，刘晓晔，董 虹* (.北京农学院 兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京02206;2.北京大学，北京 0087)

畜牧养殖业中常用作抗生素替代物的饲料添加剂主要包括益生菌、植物提取物、中草药、天然多糖和天然抗菌肽等[1-2]。其中中草药因其具有资源丰富、功能多样、毒性低等特点，被广泛应用于饲料添加剂[3]。根据中草药添加剂的特点和应用效果大致可分为免疫增强剂如刺五加、菜豆;抗微生物剂连翘、蒲公英;激素样作用剂甘草、肉桂，増食剂五味子和鼠尾草等[4-5]。黄酮类中药是中药有效成分的重要一类，具有抗氧化、免疫调节等功能，在畜牧业中也被用作饲料添加剂在猪、反刍动物及鱼类生产中应用，具有开发前景[6-8]。目前,黄酮类中药被发现具有良好的抗溶血素效果，尤其是对金黄色葡萄球菌α-溶血素、李斯特菌溶血素及猪链球菌溶血素具有较好的抑制效果，主要通过抑制溶血素基因编码、基因转录或直接中和溶血素等途径抑制其活性。本研究将近年来对细菌溶血素具有良好抑制效果的黄酮类中药进行总结归纳，为研究抗细菌溶血素机制和开发新型黄酮类中药饲料添加剂提供参考。

1 溶血素分类概述

溶血素概念是FUSSLE等[9]在1981年研究金黄色葡萄球菌α-毒素作用机制时提出的。早期溶血素多根据其抗原特性进行命名，而目前针对新发现的溶血素主要根据其特性以菌名加溶素后缀(-lysin)进行命名[10]。根据溶血素的作用机制等不同可将溶血素分为两大类，即重复子毒素家族(repeats in toxin family，RTX)和胆固醇依赖细胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysin family，CDC)[11]，代表性溶血素的主要毒性作用见表1[12-20]。其中,重复子毒素家族主要为革兰阴性菌产物，代表性成员为埃希大肠杆菌溶血素(HlyA)，家族中其他溶血素有30%～75%基因序列与HlyA相同[21]。此家族具有9个串联氨基酸重复出现的特殊分子结构，且它们在发挥致病作用时离不开Ca2+的帮助，需9肽结合区与钙离子结合后才能发挥其毒性[22]。胆固醇依赖细胞溶素，主要由革兰阳性菌产生，常见家族成员见表1[15]。正如他们的家族名字一样，此类溶血素在发挥致病作用时需要借助靶细胞膜上的胆固醇。首先与靶细胞表面的胆固醇受体结合并通过复合变构，最终插入细胞膜中形成寡聚β-桶状跨膜孔道而达到致病作用[23]。除此之外还有个别溶血素未归到以上两大家族，如金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)等。

表1 常见溶血素的毒性作用

2 黄酮类中药抗溶血素的作用机制

黄酮类中药主要为2个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接而成，具有C6-C3-C6结构的一系列化合物，多依据中央三碳链的氧化程度及是否成环和连接B环位置等结构特点将其进行分类[24]。黄酮类中药分布广泛，是多种经典方剂中中草药的主要活性成分，目前研究表明黄酮类中药具有抑菌消炎[25]、保护血管内皮细胞免受损伤[26]、调节免疫相关信号通路[27]等多种生物学活性。除此之外，黄酮类中药对细菌溶血素亦具有很好的抑制效果，主要通过直接阻止溶血素的生成或中和溶血素两方面来实现对其的抑制效果。

这些黄酮类中药具有明确的化学结构及性质，较复方中药而言化学成分单一且纯度较高，可以更好更深入地研究其抑制溶血素的具体机制，并将功能细化到结构，为后续抗毒素中药筛选提供方向指导。本研究将近几年来对细菌溶血素具有抑制作用的黄酮类中药进行分类汇总，发现主要为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类及查尔酮类，且主要对Hla、单增李斯特菌细胞溶素(LLO)及猪链球菌细胞溶素(SLY)具有较好的效果。

2.1 黄酮类黄酮类即以2-苯基色原酮为基本母核的一类化合物类，与黄酮醇类的区别在于基本母核的C3位上无羟基或其他含氧取代基。常见的有芹菜素、香叶木素、黄芩苷、木蝴蝶素A、黄芩素、白杨素及木犀草素等，这些黄酮类中药都具有抑制溶血素效果(图1)。这些化合物分子结构平面性较强、分子排列紧密、分子间引力较大，故而难溶于水，黄酮醇类及查尔酮类亦是如此。在酸碱性方面，黄酮类中药的酸性强弱与酚羟基的数目和位置有关。其中R2及R6位置取代基为羟基时，受P-Π共轭效应影响，酸性强于一般酚羟基，当R4位置取代基为酚羟基时，由于与羰基形成分子内氢键故酸性弱于一般酚羟基[28]。

1.芹菜素,R1-H,R2-OH,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH；2.香叶木素,R1-H,R2-OCH3,R3-OH,R4-OH,R5-H,R6-OH；3.黄芩苷,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OH,R6-CO(CHOH)4COOH；4.木蝴蝶素A,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OCH3,R6-OH；5.黄芩素,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OH,R6-OH；6.白杨素,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH；7.木犀草素,R1-OH,R2-OH,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH

芹菜素是一种可以从多种中药，如半枝莲[29]、女贞子[30]、紫苏[31]、马齿苋[32]等中提取的常见的黄酮类中药。对于芹菜素的研究前期主要集中在对癌症的预防及治疗方面，而近期研究发现芹菜素可以通过抑制hla和agrA基因的转录降低金黄色葡萄球菌Hla的分泌，来抑制溶血活性[33-34]。其中hla是Hla的编码基因，由agrA二元调控系统正调节，两者在调节毒力因子表达方面发挥关键作用[35]。随后研究发现在抑制Hla分泌上，噬菌体裂解酶(Lys GH15)与芹菜素联合应用的效果优于单独应用芹菜素，它们两者表现出微弱的协同作用[36]。这提示黄酮类中药联合疗法的潜在价值。香叶木素也被证明通过相同的机制抑制Hla的分泌[37]。

除了可直接通过降低Hla的表达来抑制溶血活性外，一些黄酮类中药虽不能影响Hla的产生但却仍以剂量依赖的方式抑制其活性。主要原因是这些黄酮类中药抑制了Hla七聚体的形成。研究发现黄芩苷通过与Hla“三角形区域”残基Y148、P151和P153结合，抑制Hla七聚体的形成,继而对其活性产生抑制作用，最终阻断其对机体的损害作用[38]。黄芩苷与Hla结合的分子动力学模拟构象见图2。除黄芩苷外，木蝴蝶素A也被发现可以通过抑制Hla七聚体的形成影响溶血活性。但其与Hla作用的结合位点与黄芩苷不同。木蝴蝶素A通过结合Hla的Thr11、Thr12、Ile14、Gly15和Lys46残基，破坏关键的“环状”结构进而阻止Hla七聚体的形成，抑制溶血活性[39]。木蝴蝶素A与Hla结合的分子动力学模拟构象见图3A，最终结合位点的静电势见图3B，其中蓝色为正电荷区域，红色为负电荷区域，白色为中性区域。此外以上4种黄酮类化合物均可保护人肺泡上皮(A549)细胞免受金黄色葡萄球菌在共培养系统中引起的损伤。

图2 黄芩苷与α-溶血素结合的分子动力学模拟构象[38]

图3 木蝴蝶素A与α-溶血素结合的分子动力学模拟构象[39]

在研究针对李斯特菌溶血素的黄酮类中药时，发现黄芩素及白杨素不抑制LLO的合成，可直接中和单增李斯特菌培养物上清及纯化的LLO从而介导成孔活性[40]。木犀草素不抑制LLO编码基因(hly)的转录，但可特异性地抑制hly的翻译，从而降低单增李斯特菌菌体内外LLO含量。

2.2 黄酮醇类黄酮醇类中药对于Hla、LLO及SLY均有抑制作用。据报道，异鼠李素，一种从药用植物如银杏[41]、沙棘[42]等中提取分离得到的，同时也在很多植物的花、叶和果实中存在的黄酮醇类中药，通过下调RNAⅢ表达，抑制hla转录来达到抑制Hla分泌的效果，同时局部异鼠李素处理可保护免受金黄色葡萄球菌对A549细胞介导的细胞损伤[43-44]。其中RNAⅢ基因是正向调控Hla的二元调控系统agr的效应因子[35]。研究发现漆黄素不影响LLO的合成分泌但可通过抑制LLO与胆固醇的结合，阻止LLO的寡聚化作用，而降低其成孔活性，从而减少单增李斯特菌介导的细胞毒性[45]。另外，在对SLY抑制作用的研究中发现，黄酮醇类中药桑色素可抑制SLY的溶血活性，但桑色素本身并不影响SLY的表达，而是通过直接中和SLY起到的抑制作用，同时还可显著缓解猪链球菌介导的宿主细胞(J774细胞)损伤[46]。黄酮醇类中药异鼠李素、漆黄素和桑色素结构见图4。

1.异鼠李素,R1-H,R2-OCH3,R3-OH,R4-OH,R5-OH；2.漆黄素,R1-H,R2-OH,R3-OH,R4-H,R5-OH；3.桑色素,R1-OH,R2-H,R3-OH,R4-OH,R5-OH

2.3 二氢黄酮类二氢黄酮类为中央三碳原子C2、C3位双键被还原为单键的一类黄酮类中药[24]。如柚皮素和橙皮素等(图5)。这类化合物的分子结构为非平面，分子排列不紧密，分子间引力较小,有利于水分子进入故而水溶性相对较大[28]。柚皮素是一种可从化橘红、枳实及各种柑橘类水果(如葡萄柚、柚子、橙等)的果皮果肉中得到的二氢黄酮类中药[47]。研究发现，发现柚皮素对于金黄色葡萄球菌所致的小鼠肺炎具有较好的疗效[48]，随后张雨[49]在其研究中发现柚皮素可通过抑制hla的转录水平来降低Hla的表达量，从而抑制溶血活性保护机体。此外，柚皮素还可以抑制金黄色葡萄球菌其他外毒素如，SEA、SEB和TSST-1的表达，并且同样对A549细胞具有保护作用。橙皮素也被发现具有抑制Hla的作用，其作用机制与上述黄酮醇类中药异鼠李素相同[50]。

图5 二氢黄酮类中药结构

2.4 查尔酮类查尔酮类的主要结构特点是C环未成环。其中被大家熟知的如：根皮素和甘草查尔酮E等，结构见图6。研究发现，根皮素与甘草查尔酮E都以与黄酮类中药芹菜素相同的机制抑制金黄色葡萄球菌Hla，其中根皮素还可保护A549细胞免受金葡菌的损伤[51-52]。除此之外，在根皮素的研究中还发现其可抑制单核细胞增生李斯特菌中的LLO表达，在研究其机制时发现根皮素处理并没有影响hly转录，猜测可能是由于抑制了细胞质中LLO翻译导致[53]，黄酮类中药对溶血素的抑制机制总结见表2。

图6 查尔酮类中药结构

表2 黄酮类中药对溶血素的抑制机制

3 讨论

细菌溶血素是细菌致病的重要毒力因子，以溶血素为靶标，通过中和或抑制其分泌，降低细菌的致病性，随后调动天然免疫细胞将细菌清除，可在保护机体的同时阻止细菌耐药性的产生。以溶血素为目标进行干预，从而达到抗菌目的是当今研究的热点，也是筛选抗菌药物的一条新方向。

而目前在抑制细菌溶血素的研究中，越来越多的中药被研究，并发现具有较好的抑制效果。但中药成分的复杂性是研究的一大难题，而中药单体较中药而言具有明确的化学结构及理化性质，从而更利于研究。本研究总结各种结构的黄酮类中药在抑制溶血素方面所发挥的作用，看到这类中药在治疗细菌性疾病中的巨大潜力。我国中药资源丰富，黄酮类中药分布广泛，以黄酮类结构为导向筛选抗毒素药物，对于研发新型抗菌药、开发中药饲料添加剂具有重大意义。同时在中药复方的研究中，针对具有抗菌效果的中药复方，如白头翁汤等，或许可通过增加富含对溶血素有抑制效果的黄酮类成分的中药，以优化中药复方在治疗细菌感染方面的作用。此外这些黄酮类中药或许在一些由毒素引起的细菌混合感染中具有潜在作用。由此，在目前研究基础上继续开发利用黄酮类中药具有巨大前景。