HA蛋白S227N突变对H7N9亚型禽流感病毒生物学特性与疫苗免疫原性的影响

胡增垒，石 磊，赵江艳，顾 晗，胡 娇,4，曹永忠，刘秀梵* (1.扬州大学 教育部农业与农产品安全国际联合实验室，江苏 扬州 225009；2.扬州大学 农业科技发展研究院，江苏 扬州 225009；.扬州大学 兽医学院 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏 扬州 225009；4.扬州大学 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009；5.扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009)

H7N9亚型禽流感是严重威胁公共卫生与养禽业发展的重要的人兽共患病，H7N9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)于2013年在中国长三角地区出现以来，在我国共造成5个波次的人间流行[1-2]。截至2020年5月，世界卫生组织(WHO)数据统计，共有1 568例实验室确诊人感染H7N9亚型AIV，死亡率接近40%。2016年底，H7N9亚型AIV出现变异毒株，其血凝素(hemagglutinin,HA)裂解点位7出现“KRTA”4个氨基酸插入，使其具备高致病性AIV特征。随后，在人、鸡群、活禽市场与环境样品中不断检出高致病性H7N9亚型毒株[3]。根据世界动物卫生组织(OIE)统计，至2020年5月，高致病性H7N9亚型AIV在我国共造成11起家禽疫情暴发，约80万只家禽被扑杀。

疫苗接种是禽流感防控的有效措施之一，H7N9亚型AIV出现以来已研制出许多候选疫苗株，包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗与病毒载体疫苗等[4]。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示,H7N9亚型疫苗可诱导高水平的HA特异性IgG抗体，但传统的血清学方法(如HI、VN试验)测定的抗体滴度却不能反映疫苗真实的免疫原性。这些疫苗在动物试验中均显示出较强的免疫原性与保护效力，在人临床试验中，疫苗诱导的血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)与病毒中和(virus neutralization,VN)抗体普遍偏低，往往需要进行加强免疫或在疫苗中添加佐剂[5-6]。此外，小鼠与家禽中进行的H7N9亚型疫苗评价试验也得到相似结果[7-10]。

HI试验测定抑制流感病毒与红细胞唾液酸体结合的抗体，因此HI试验的敏感性是决定流感疫苗HI抗体检测率的关键因素。HI试验所用诊断抗原的受体结合特性对其敏感性有重要影响。研究显示，HA蛋白中一些影响病毒受体特异性的关键位点，如受体结合位点(receptor binding site,RBS)中第190、226与228位氨基酸(基于H3亚型流感病毒HA蛋白计数)，对流感疫苗的免疫原性与效力有重要作用[11-13]。一些H5亚型禽流感疫苗(如H5N3亚型A/Duck/Singapore/3/97；H5N1亚型A/HK/156/97)诱导的HI或VN抗体滴度很低，但某些H5亚型疫苗(如H5N1亚型A/HK/156/97)却可以诱导很高的HI抗体。序列分析显示，免疫原性较弱的病毒HA蛋白RBS第227位氨基酸均为丝氨酸(S)，免疫原性较强的病毒该位点为天冬氨酰(N)，提示227位氨基酸位点可能与H5亚型禽流感疫苗的免疫原性有关。LIPATON等[15〗报道，将H5N1亚型AIV(A/Vietnam/1203/04)HA蛋白第227位S突变为N后，疫苗在雪貂中诱导的HI抗体显著提高，且不同的H5病毒抗血清与含有S227N突变病毒的HI滴度均显著提高，说明S227N突变增强了HI抗体的检测敏感性。后续研究在更多的H5亚型禽流感疫苗中验证了S227N突变对疫苗免疫原性的增强作用，且证明S227N突变对病毒受体结合特性的改变可能与HI抗体的提高有相关性[16]。但HA蛋白第227位氨基酸与H7N9亚型禽流感疫苗较低的HI抗体应答是否相关还不清楚。

本课题组前期以H7N9亚型AIV(A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15株)为母本病毒，构建HA蛋白裂解位点突变的致弱病毒(rGD15)及含有HA S227N突变的重组病毒(rGD15HAS-227N)[17]。本研究评价HA蛋白S227N突变对病毒致病性、复制、受体结合特性的影响，并分析该位点突变对疫苗免疫原性与血清交叉反应性的影响，为H7N9亚型禽流感疫苗的优化改造提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、质粒与细胞以H7N9亚型AIV(GD15株)为母本病毒，HA蛋白裂解位点去除“KRTA”氨基酸的重组致弱H7N9亚型病毒rGD15株和含有HA S227N突变的重组病毒rGD15HAS227N由胡增垒等[17]构建；H7N9亚型病毒分离株(A/chicken/Guangxi/GX110/2017、A/chicken/Hebei/SJ27/2017、A/chicken/Guangdong/HZLH1/2017、A/ch-icken/Jiangsu/TM24/2013、A/chicken/Zhejiang/J-X148/2014、A/chicken/Jiangsu/RG126/2015)由农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离保存，作为交叉HI试验的抗原；H5N1亚型AIV(A/mallard/Huadong/S/2005,HD/05株)与人源H1N1亚型毒株(A/California/04/2009,CA04株)由本室保存，用于病毒受体特性测定对照；293T与MDCK细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养；鸡胚成纤维细胞(CEF)按照常规方法制备，在含有4%胎牛血清的M199培养基中培养。

1.2 H7N9亚型免疫血清前期基于rGD15与rGD15HAS227N制备了油乳剂灭活疫苗，免疫SPF鸡后获得H7N9亚型抗血清；用其他H7N9亚型病毒(JX148、TM24、RG126、SJ27)为抗原制备的免疫鸡血清均由本实验室保存。

1.3 鸡胚与主要试剂SPF鸡胚购自浙江立华农业科技有限公司，孵化至10日龄使用；生物素标记的α-2,3(Neu5Acα-2,3-LacNAcb-PAA-biotin)与α-2,6糖链(Neu5Acα-2,6LacNAcb-PAA-biotin)购自GlycoTech公司；H7N9亚型 HA蛋白特异性单克隆抗体购自北京义翘神州公司。

1.4 H7N9亚型病毒生物学特性的鉴定按照文献[18]方法测定母本病毒rGD15与突变病毒rGD15HAS227N接种SPF鸡胚后的平均死亡时间(MDT)，评价病毒的致病性；测定病毒的HA效价与半数鸡胚感染剂量(EID50)，评价病毒的繁殖性能；将H7N9亚型病毒接种SPF鸡胚，于接种后24、48、72、96 h收获尿囊液，并感染CEF细胞测定病毒的半数组织细胞感染量(TCID50)，评价病毒的生长动力；利用基于固相载体的糖链试验测定H7N9亚型病毒的受体结合特性。

1.5 HA蛋白结构的模拟分析为了分析S227N突变对HA蛋白的结构的影响，将GD15株HA氨基酸序列与含有S227N突变的序列上传至SWISS-MODEL数据库(https://www.swissmodel.expasy.org/)进行同源建模[19]，并用PyMOL软件对HA蛋白结构进行分析。

1.6 HI抗体测定测定GD15与rGD15HAS227N疫苗免疫鸡后第2、3周采集血清的HI抗体滴度，按照标准流程进行，所用抗原为疫苗的同源病毒。

1.7 交叉HI试验为了评价S227N突变对H7N9亚型疫苗免疫血清交叉反应性的影响，用rGD15与rGD15HAS227N灭活疫苗免疫血清与H7N9亚型野毒株进行交叉HI试验；为了分析S227N突变对HI试验敏感性的影响，用不同的H7N9亚型抗血清与rGD15与rGD15HAS227N病毒进行交叉HI试验。

2 结果

2.1 含有HA S227N突变的H7N9亚型重组病毒的生物学特性重组病毒rGD15HAS227N及其母本病毒rGD15对鸡胚的MDT均大于120 h，显著高于野生型病毒GD15株的MDT值(36 h)，说明HA裂解位点去除“KRTA”氨基酸使病毒致病性显著降低(表1)。rGD15与rGD15HAS227N的HA效价与EID50与野生病毒相似，均保持在较高水平(表1)。此外，病毒生长曲线显示，rGD15HAS227N在鸡胚中的复制性能略低于rGD15，但是每个时间点的病毒滴度差异维持在1 lg之内(图1)。以上结果说明，HA蛋白S227N突变对母本病毒rGD15的致病性与复制性能无明显影响。

表1 H7N9亚型重组病毒的生物学特性

图1 H7N9亚型重组病毒在鸡胚中的生长曲线

2.2 H7N9亚型病毒的受体结合特性与HA蛋白结构模拟分析由于227位点位于HA蛋白的RBS内，故用糖链结合试验评价S227N突变对H7N9亚型病毒受体结合特性的潜在影响。结果发现，H7N9亚型病毒rGD15与α-2,3及α-2,6唾液酸受体均显示较高的亲和力(图2A)，说明该病毒为双受体结合特性；rGD15HAS227N也可与α-2,3及α-2,6唾液酸受体结合，但是亲和力与母本病毒rGD15相比明显下降(图2B)。对照病毒H5N1亚型AIV HD/05株仅结合α-2,3唾液酸受体(图2C)，而人源H1N1 CA04株仅结合α-2,6唾液酸受体(图2D)，说明2个对照病毒均为单受体结合特性，糖链结合试验成立。此外，HA蛋白构象模拟显示，227位氨基酸残基位于HA蛋白RBS的220-loop内(图2E)；S在HA蛋白表面占据的分子空间较小，N占据的分子空间更大，但是位点突变对与唾液酸受体直接结合的位点(226与228位)的构象没有明显影响(图2F)。结果说明，HA S227N突变不改变GD15株的双受体结合特性，却可以导致病毒与唾液酸受体亲和力的显著下降，使病毒与受体的结合更加松散；受体特性的改变可能与S227N突变导致的HA蛋白构象变化有关。

A.H7N9-rGD15;B.H7N9-rGD15HAS227N;C.H5N1-HD/05;D.H1N1-CA04;E.227位氨基酸在HA RBS中的定位;F.RBS内关键位点(226，227，228位)在HA蛋白表面的构象

2.3 S227N突变对H7N9亚型疫苗免疫原性的影响疫苗免疫后第2周，rGD15诱导的平均HI抗体滴度为3.8 log2，rGD15HAS227N诱导的HI抗体滴度为5.4 log2，两者之间的差异接近4倍(图3A)。免疫后第3周，两个疫苗诱导的抗体水平均明显上升，rGD15HAS227N诱导的HI滴度(7.4 log2)显著高于rGD15(5.5 log2)(图3B)。说明S227N突变可以显著提高H7N9亚型灭活疫苗诱导的HI抗体水平。

A.第2周;B.第3周；*P <0.05；虚线代表HI试验阳性读数的临界值4 log2

2.4 S227N突变对H7N9亚型免疫血清交叉反应性的影响交叉HI试验显示(表2)，rGD15血清与同源抗原的HI滴度为6 log2，与rGD15HAS227N抗原的HI滴度上升4倍(8 log2)。此外，rGD15血清与近期高致病性H7N9亚型分离株(2017年)及早期低致病性毒株(2013—2015年)的HI滴度均与同源滴度相近。rGD15HAS227N血清与同源抗原的HI滴度为8 log2，与rGD15病毒的HI效价下降4倍；与H7N9亚型野毒株的交叉反应性与rGD15的反应谱相似。结果表明，rGD15血清与不同的H7N9亚型分离株有较好的交叉反应性，而HA S227N突变对这一特性无明显影响。

表2 H7N9亚型疫苗免疫血清的交叉反应性

2.5 S227N突变对HI试验敏感性的影响测定不同H7N9亚型血清与rGD15及rGD15HAS227N病毒的HI滴度，评价S227N突变对HI试验敏感性的影响。结果显示，所有H7N9亚型血清与rGD-15HAS227N病毒的HI滴度比针对rGD15病毒的滴度均上升2 log2(表3)，说明用含有S227N突变的病毒作为检测抗原，HI试验的敏感性上升4倍。

表3 H7N9亚型血清与H7N9亚型重组病毒的HI滴度

3 讨论

HI抗体滴度是评价流感疫苗免疫原性与保护效力最常用的免疫学指标。对于成人的季节性流感疫苗，HI抗体滴度大于1∶40认为可将流感病毒的感染风险降低50%左右[20-21]。对于家禽流感疫苗，HI抗体水平大于1∶32认为可提供较好的临床保护。但是，动物模型与人群中的免疫试验显示，H7N9亚型禽流感疫苗诱导的HI抗体普遍较低，往往低于HI试验的检测下限[5-6]。因此，许多研究基于这种抗体应答特征认为H7N9亚型禽流感疫苗的免疫原性较弱。但利用ELISA方法可以检测到H7N9亚型疫苗诱导高水平的IgG抗体，说明疫苗具有较强的免疫原性，而传统的血清学试验(如HI试验)不能真实反映疫苗诱导的抗体应答。

有报道显示，HA蛋白中与唾液酸受体直接结合的位点(第226与228位氨基酸)与流感疫苗的免疫原性密切相关[11-12,22]。此外，HA蛋白RBS内的其他关键位点，如第227位氨基酸，对流感疫苗的免疫原性也有重要影响。HOFFMANN等[14]研究显示，HA蛋白第227位氨基酸为S的H5N1亚型禽流感疫苗诱导的HI抗体滴度很低，而该位点为N的疫苗则可以诱导高水平HI抗体；S227N突变能够显著增强疫苗的免疫原性，且S227N突变改变H5N1病毒受体结合特性，显著提高HI试验的敏感性。本研究得到相似结果，HA蛋白S227N突变使H7N9亚型AIV与α-2,3及α-2,6唾液酸受体的亲和力显著下降，病毒与受体的结合更为松散。含有S227N突变的H7N9亚型疫苗诱导的HI抗体显著高于未突变疫苗诱导的抗体，与突变病毒受体结合特性改变相关。此外，其他H7N9亚型血清针对含有S227N突变病毒的HI滴度比针对未突变病毒的滴度均增加4倍。这些结果说明，使用含有S227N突变的H7N9亚型重组病毒作为诊断抗原可显著提升HI试验的敏感性。

H7N9亚型AIV为典型的双受体结合特性，病毒与α-2,3及α-2,6唾液酸受体均有较强的亲和力[23]。因此，使用H7N9亚型病毒作为HI抗体检测抗原时，需要较高浓度的抗体才能阻断病毒与红细胞唾液酸受体的结合，降低HI试验的敏感性。S227N突变可降低病毒与受体的亲和力，但具体的机制还不清楚。本研究中HA结构模拟提示，S227N突变改变了氨基酸位点在HA蛋白表面占据的分子空间，但是这种改变与病毒受体特性变化之间的相关性还有待研究。

此外，近期分离的H7N9亚型AIV与早期毒株之间存在明显的抗原性差异。较广的反应谱是高效H7N9亚型禽流感疫苗的理想特性。结果显示，rGD15免疫血清与不同的H7N9亚型野毒株均具有较好的交叉反应性，而S227N突变对血清的反应谱没有明显影响，说明该位点突变不影响H7N9亚型病毒的抗原性。

综上，本研究证实HA蛋白第227位氨基酸位点对H7N9亚型禽流感疫苗免疫原性的评价有重要影响。HA S227N突变可改变病毒的受体结合特性、增加HI试验的敏感性、增强H7N9亚型疫苗的免疫原性。研究结果对于H7N9亚型禽流感疫苗免疫原性的增强及疫苗的临床评价有重要的参考意义。