不同氮素水平下大麦谷氨酰胺合成酶基因(HvGS1)表达及其与籽粒氮素积累的关系

2021-04-12徐寿军刘志萍郭呈宇吕二锁董永义张继星薛海楠李国兴德木其格

麦类作物学报 2021年1期

徐寿军，刘志萍，郭呈宇，吕二锁，董永义，张继星，薛海楠，王磊，李国兴，德木其格

(1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028043；2.内蒙古农牧业科学研究院作物所，内蒙古呼和浩特 010031)

氮素是限制作物产量的主要营养元素之一，无论是直接来源于硝酸盐、胺离子、微生物固定的氮，还是植物代谢过程中释放的氨，都必须经过谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS) 催化才能同化为氨基酸[1]，进而合成蛋白质。GS是作物籽粒蛋白质合成的关键酶[2-3]，分布在作物的根、茎秆、叶片、果实、种子等器官中，直接影响作物对氮素的吸收和利用。其在作物体中通常有两种存在形态：一是细胞质型，存在于细胞质中，称为GS1；二是叶绿体型，存在于叶绿体中，称为GS2。GS1一直是植物生理学和营养学方面的研究热点，主要参与种子萌发时储存氮素的转运和叶片衰老时氮源的转移与再利用[4-5]。

灌浆期是大麦等作物籽粒产量和蛋白质形成的关键时期，其籽粒中的氮素来源包括营养器官转移的氮素和植株从土壤中吸收的氮素。Tabuchi等[12]研究表明，HvGS1对于水稻籽粒灌浆起非常关键的作用，HvGS1缺失后水稻植株的灌浆速率和灌浆程度都严重降低。就麦类作物而言，籽粒中的氮素积累主要来自生育后期营养体中氮素的重新分配[13]。小麦籽粒中约70%的氮来自花前氮素同化[14-15]，大麦生育后期根部吸收的氮素并不多，作物花前茎秆、叶片等营养器官积累氮素向籽粒转运是籽粒氮素的重要来源[16-17]。大麦叶片中HvGS1表达的变化与营养器官储存氮素的转运关系密切，在籽粒灌浆期间，营养器官HvGS1的表达动态如何，如何影响籽粒氮素积累，目前此方面的研究尚未见报道。本研究以大麦品种蒙啤1号、蒙啤3号、甘啤4号和垦啤7号为试材，研究了不同氮肥用量下大麦灌浆期间叶片HvGS1表达及其与籽粒氮素积累的关系，以期为优质高产大麦栽培生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验于2016和2017年在内蒙古通辽市科尔沁区农牧业高新科技示范园区试验农场进行(43°63′N,122°25′E)。试验地土壤肥力均匀，耕层土壤有机质含量为17.52 g·kg-1，碱解氮含量为45.20 mg·kg-1，速效磷含量为28.32 mg·kg-1，速效钾含量为128.52 mg·kg-1，pH为8.1。该地年平均气温6.1 ℃，≥10 ℃活动积温3 160 ℃，日照时数3 113 h，年平均降水量 350 mm。

1.2 试验材料及设计

供试大麦品种为蒙啤1号、蒙啤3号、甘啤4号和垦啤7号，均由内蒙古农牧业科学院提供。试验设0、90、180和270 kg·hm-24个氮肥水平，分别记为CK、NL、NM和NH。氮肥分2次施入，70%氮肥在播种时施入，其余氮肥在拔节时追施。每个处理均基施P2O5120 kg·hm-2和K2O 75 kg·hm-2。小区面积20 m2，每小区16行，行长5 m，行距0.25 m。每行播种500粒，人工点播，3叶期间苗，株距2 cm。随机区组设计，3次重复，2016年3月26日播种，2017年3月25日播种，栽培管理同大田。

1.3 样品的采集、测定

各小区选择长势相近、同一天开花的大麦植株标记。于花后7、14、21和28 d及成熟期分别取所标记大麦20株，按叶片、茎秆、籽粒等不同部位分开，10株放于液氮中快速冷冻，然后转移到-80 ℃冰箱内保存，用于测定HvGS1相对表达量。另外10株在105 ℃下杀青0.5 h，80 ℃下烘干至恒重，用小型粉碎机粉碎后凯氏定氮法测定氮含量[18]。

HvGS1相对表达量采用荧光定量PCR 技术测定。总RNA提取后逆转录合成cDNA，再荧光定量PCR扩增。参照Gene Bank 数据库中各目的基因的序列，根据ABI公司的Primer Express Software v2.0设计引物(表1)。反应体系(16 μL)包括H2O 5 μL、2×SYBGEEN PCR mix 8 μL、上下游引物(10 pmol μL-1) 各1 μL、模板cDNA 1 μL。反应程序:95 ℃预变性2 min； 95 ℃ 10 s,72 ℃ 40 s,50个循环。结果采用2-⊿⊿Ct算法来计算[19]。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 数据处理

利用Microsoft Office Excel 2007软件和SPSS(19.0)数据处理系统进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮肥处理下大麦灌浆期间叶片氮含量的变化

由表2可知，随着灌浆进程，4个品种叶片氮含量均呈逐渐降低的趋势。随着施氮水平的增加，各时期各处理叶片氮含量逐渐增加。2年的变化趋势基本一致。

2016年，在花后7 d时，蒙啤1号和蒙啤3号NL处理的叶片氮含量与CK差异均显著，NM与NH处理间差异均不显著。甘啤4号和垦啤7号的4个处理间差异均显著。在花后14 d时，蒙啤3号NL处理的氮含量与CK差异不显著，其他处理与CK差异均显著；其他品种在NM和NH处理间差异均显著。在花后21 d时，4个品种NL处理的氮含量与CK差异均不显著， NM和NH处理与CK间差异均达到显著水平，NL、NM处理间差异均不显著，二者与NH处理间差异均显著，NM与NH处理间差异均不显著。在花后 28 d时，蒙啤1号和蒙啤3号NL处理的氮含量与CK差异均不显著， NM和NH处理与CK差异均达到显著水平。NL与NM、NM与NH处理间差异均不显著。甘啤4号和垦啤7号NL和NM处理与CK差异均不显著， NH处理与CK差异均达到显著水平。

2017年，在花后7 d时，4个品种的NL处理叶片氮含量与CK差异大部分显著，NM与NH处理间差异均不显著。在花后14 d时，蒙啤1号、甘啤4号NL处理的氮含量与CK差异均不显著，其他处理与CK差异均显著；蒙啤3号、垦啤7号施氮处理与CK间差异均达到显著水平。在花后21 d时，除蒙啤3号外，其他3个品种NL处理的氮含量与CK差异均不显著， NM和NH处理与CK差异均显著。在花后28 d时，蒙啤1号和垦啤7号NL处理的氮含量与CK 差异均不显著，NM和NH处理与CK差异均显著。NL与NM、NM与NH处理间差异均不显著。蒙啤3号和甘啤4号的NL处理与CK 差异均不显著，NH和NM处理与CK差异均显著。

2.2 不同氮肥处理下大麦灌浆期间叶片 HvGS1相对表达量的变化

由图1和图2可知，随着灌浆进程，大麦叶片HvGS1相对表达量均呈逐渐升高的趋势，一直到花后28 d仍维持较高的表达水平；各时期各处理随着施氮水平的增加，HvGS1相对表达量均上调，说明增施氮肥可提高叶片HvGS1相对表达量。

表2 不同氮肥处理大麦叶片氮含量变化Table 2 Changes of nitrogen content in barley leaves under different nitrogen levels %

2016年，在花后7 d时，蒙啤1号叶片HvGS1相对表达量在不同处理间差异均显著，其他3个品种NL与CK、NM与NH处理间差异均不显著，NL与NM处理间差异均显著。在花后14 d时，除甘啤4号外，其他品种的施氮处理与CK间差异均达显著水平，NM与NH处理间差异均不显著。在花后21 d时，蒙啤1号和甘啤4号NL处理与CK间差异均不显著， NM和NH处理与CK差异均显著，NM与NH处理间差异均显著。蒙啤3号和垦啤7号的CK、NL、NM处理间差异均不显著，三者与NH处理差异均显著。在花后28 d时，蒙啤1号的NM与NH处理间差异不显著；甘啤4号的NL处理与CK、NM处理间差异均不显著，NM与NH处理间差异不显著；蒙啤3号、垦啤7号的NM与NH处理间差异均不显著，但二者与其他处理间差异基本均达到显著水平。

2017年，在花后7 d时，蒙啤1号和蒙啤3号的叶片HvGS1相对表达量在NL处理与CK间、 NL与NH处理间差异均显著。在花后14 d时，除蒙啤1号外，其他品种施氮处理与CK间差异均显著。在花后21 d时，蒙啤1号和蒙啤3号NL处理与CK间差异均不显著，NM和NH处理间差异均显著，NM与NL处理间差异均不显著。甘啤4号和垦啤7号NL处理与CK间差异均不显著。在花后28 d时，蒙啤1号的NL与NM处理差异不显著，垦啤7号的NL处理与CK差异不显著，其他品种的不同处理间差异均显著。

2.3 不同灌浆时期叶片 HvGS1相对表达量与供氮水平及叶片氮含量的相关性

相关分析(表3)表明，大麦各灌浆时期叶片HvGS1相对表达量与供氮水平及叶片氮含量均呈极显著正相关，说明在本试验设定范围内，增加施氮量会促进大麦叶片氮素积累，并引起HvGS1呈上调表达。不同灌浆时期叶片HvGS1的相对表达量与成熟期籽粒氮含量均呈显著或极显著正相关，其中花后28 d的相关性最大，相关系数达到0.514 7，表明大麦叶片中HvGS1的上调表达有助于提高成熟籽粒的氮素含量，有利于改善最终品质。

进一步的通径分析(图3)表明，对成熟期籽粒氮含量影响最大的也是花后28 dHvGS1表达水平，直接通径系数为0.490 6；其次是花后7 dHvGS1表达水平，直接通径系数为0.211 3。从相关性结果看，4个时期HvGS1相对表达量与成熟期籽粒氮含量均呈正相关，但通径分析结果却显示，花后21 d的HvGS1表达水平与成熟期籽粒氮含量呈负相关，这是因为花后 21 d与花后 7 d、14 d和28 d的HvGS1表达水平间均存在极显著的相关关系，从而掩盖了其实质效应。

表3 叶片 HvGS1相对表达量与供氮水平及氮含量的相关系数Table 3 Coefficients of correlation between relative expression of HvGS1 and nitrogen supply level and nitrogen content in leaves

3 讨论

高等植物中HvGS1表达是一个复杂过程，在不同条件下、不同植物或种属间表达量均存在差异。众多学者对作物不同生育时期HvGS1的表达动态进行了研究，烤烟叶片HvGS1表达丰度在叶龄 35 d 时非常低，叶龄 45 d 时HvGS1表达丰度大幅上调，在叶龄 55 d 时达到最大值，随后该基因逐渐下调表达[20]。徐振华等[21]研究认为，在水稻灌浆过程中籽粒HvGS1.3的表达量呈单峰曲线变化，峰值出现在抽穗后15～20d。金正勋等[22]研究也认为，水稻叶片和籽粒中HvGS1的表达量在灌浆进程中呈单峰曲线变化，先逐渐升高，达到峰值后快速下降，峰值出现在灌浆中期(花后20 d)。在低氮条件下，小麦地上部HvGS1的表达在抽穗期以后显著增强。在高氮条件下，HvGS1表达水平从分蘖期到抽穗期有降低的趋势，而从抽穗期到灌浆期又有升高的趋势[23]。本研究结果显示，大麦灌浆过程中，随着灌浆进程，HvGS1相对表达量呈逐渐升高的趋势，一直到花后28 d叶片即将衰老时仍维持较高的表达水平。与本研究结果一致，王小纯等[1]也发现，小麦叶片HvGS1的表达量在开始衰老时最大。

HvGS1表达受氮肥供应水平影响，不同条件下，不同作物的表达变化不尽相同，有些甚至相反。在低氮条件下，随着氮素浓度的增加，HvGS1在黄瓜中的表达量逐渐升高，但在高氮条件下，其表达并没有因为丰富的氮源而保持较高的表达量，反而受到了抑制，说明并不是氮浓度越高，HvGS1表达量越大，较高的氮素浓度反而对黄瓜的氮代谢有负面影响[10]。徐心志[24]认为，低氮能促进小麦旗叶中HvGS1的转录，而高氮则能降低其转录水平。而有研究表明，增加水稻灌浆成熟期氮素营养不仅会延长HvGS1高表达持续时间，而且可提高其转录表达量[9]。大麦方面，陈志伟等研究表明，大麦在低氮胁迫下，无论是低氮敏感基因型品种，还是耐低氮基因型品种，其HvGS1总体上来说都呈现上调表达[25]。本研究结果表明，大麦灌浆期间，叶片HvGS1相对表达量随着供氮水平的增加呈上调表达，二者具有显著的正相关关系。徐红卫等[26]研究亦表明，大麦叶片HvGS1-1的相对表达水平与不同氮素处理具有显著正相关性，这与本研究结果一致。

HvGS1相对表达量与氮含量和蛋白质含量等密切相关。Cai等[27]研究表明，转基因(HvGS1)水稻整株总氮提高，这与转基因水稻中HvGS1表达量的增加有关。超量表达HvGS1能够显著提高作物的鲜重、干重、蛋白质含量[28-30]。Habash 等[31]也发现，在小麦根中过表达HvGS1能够增加氮的积累能力，表明HvGS1表达量与氮含量呈正相关。有研究认为，水稻籽粒蛋白质含量与HvGS1.3基因的表达量是同步变化关系，表明蛋白质含量与籽粒HvGS1的表达量有很密切的关系[21]。袁晓磊等[23]研究认为，HvGS表达量的增加有利于小麦提高地上部分氮含量、生物量和产量。不同叶片的含氮量不同，其HvGS1的表达也存在差异。有研究发现，茶树叶片氮含量与HvGS1表达呈负线性相关[32]，烤烟叶片HvGS1表达丰度与叶片总氮、叶片铵浓度、质外体铵浓度以及氨气挥发量呈极显著负相关[20]。本研究结果显示，随着大麦叶片氮含量的增加，HvGS1相对表达量升高，二者间呈显著正相关；各灌浆时期叶片HvGS1相对表达量与成熟期籽粒氮含量亦呈显著正相关，说明HvGS1表达增强有利于灌浆期间营养器官的氮素转运和籽粒氮素的积累。相关和通径分析结果也表明，在灌浆各时期中，影响大麦成熟期籽粒氮含量最大的是花后28 d的叶片HvGS1相对表达量，其相关系数和直接通径系数分别为0.610 9和0.490 6。花后28 d是大麦蜡熟期，是叶片即将衰老的时间[33]，也是HvGS1在叶片中表达的高峰期，此时储存在叶片的氮开始向籽粒转运，进一步证明在麦类作物中，HvGS1与氮素的转移再利用有关，说明保持灌浆后期营养器官HvGS1高表达量，有利于氮素从源转运到库，促进籽粒氮素积累。提示在生产实践中，花后28 d可以作为判断大麦叶片氮素向籽粒转移的临界时间点，维持此期叶片HvGS1高表达量，可以保障氮源充足，有利于提高产量和品质。