NgR基因沉默神经干细胞和雪旺细胞-PLGA移植于创伤性脑损伤大鼠皮层对神经功能恢复的作用*

李丹霞，童康强，张晓璐，周佳林，韩建国，韩彦军，邵 国，张春阳

[1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院神经外科疾病研究所(转化医学)；3.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心]

创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)一直是各年龄段发病率、致残率和死亡率的主要原因之一，虽然最初的脑损伤涉及急性和不可逆的原发性脑实质损伤，但随后的继发性脑损伤通常会在数月至数年内缓慢进展，因此为治疗干预提供了一个窗口[1]。目前已经证实干细胞移植能够促进脑损伤的功能恢复，而聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)有承载细胞的能力[2]。研究神经修复机制中发现NgR(Nogo receptor)信号传导通路是其中一条重要的机制[3]，通过抑制NgR的表达，使轴突生长抑制受限，促进受损的神经结构和功能恢复。根据这些发现，我们运用组织工程学方法，将NgR基因沉默的神经干细胞(neural stem cells, NSC)和雪旺细胞(Schwann cells,SC)-PLGA复合体移植至创伤性脑损伤大鼠皮层损伤区，观察移植复合体在大鼠皮层损伤区通过改变局部微环境促进神经元的存活、轴突再生及功能恢复情况。

1 材料与方法

1.1材料 健康成年雌性Lewis大鼠48只，体重约250g。PLGA(广州创赛生物医用材料有限公司)，DEME培养基、胎牛血清(广州济恒医药科技有限公司)，兔抗鼠NgR基因抗体、山羊抗兔抗体(武汉博士德公司)；慢病毒载体构建(汉恒生物科技有限公司)；HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；NeroTMTransfection系统(赛默飞世尔生命科技有限公司)；电子颅脑损伤仪(e CCI Model-6.3，Custom Design & Fabrication，Inc，美国)；显微器械(上海金钟)。

1.2方法

1.2.1细胞准备 取E12.5 d孕母鼠胚胎，获取端脑，并分离、纯化、扩增神经干细胞和雪旺细胞，沉默NgR基因由美吉生物公司设计并合成，根据生产商的说明，使用NeroTMTransfection系统，在35 mm培养皿中用shRNA-NgR转染神经干细胞和雪旺细胞。并筛选出表达shRNA-NgR的神经干细胞和雪旺细胞，进行传代、扩增。

1.2.2细胞支架复合体的制备 PLGA经疏水蛋白HFBI和Ⅰ型胶原联合修饰后，将其剪裁成2.5 mm×1.5 mm×1.5 mm的支架，真空干燥并消毒。Ⅲ组吸取4×1 010个/L的NSC和SC各10 μL至PLGA支架内；Ⅳ组用吸取4×1010个/L的NgR基因沉默的NSC和SC各10 μL至PLGA支架。根据制造商说明，将PLGA支架复合体置于培养基中 温育24 h后，然后在37 ℃，5 %CO2湿润的培养箱中再孵育24 h。

2.1改良大鼠神经功能缺损评分(mNSS) 结果显示，与Ⅰ组比，Ⅱ组神经功能评分明显升高(P<0.05)；与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组神经功能评分明显下降(P<0.05)，且Ⅳ组优于Ⅲ组接近于Ⅰ组(P<0.05)。见表1。

1.2.3分组和TBI造模 随机将大鼠分为4组，每组12只，正常对照组(Ⅰ组)、单纯PLGA移植组(Ⅱ组)、神经干细胞+雪旺细胞+PLGA复合体移植组(Ⅲ组)、沉默NgR基因+神经干细胞+雪旺细胞+PLGA复合体移植组(Ⅳ组)。术前将大鼠置于在有自然光安静的房间内适应一周，直至不再有害怕的表情(蜷缩、尿频、便频、尖叫)。禁食水8 h后，用5 %的氯胺酮对大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后，俯卧位固定，置于立体定向仪上，剪除毛发，消毒后沿正中线切开头皮，暴露右侧顶骨，矢状缝向右旁开1.5 mm,冠状缝向后1.5 mm,磨一直径约5 mm的骨窗，暴露硬脑膜并保持硬脑膜完整。对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠行eCCI打击建立经典颅脑损伤动物模型[3]。设置打击参数：深度2 mm,速度5 m/s,锤击时间100 s。然后剪开硬脑膜，Ⅱ组于损伤区植入单纯PLGA支架，Ⅱ组于损伤区植入单纯PLGA支架，Ⅲ组于损伤区植入神经干细胞+雪旺细胞+PLGA复合体，Ⅳ组于损伤区植入沉默NgR基因+神经干细胞+雪旺细胞+PLGA复合体。移植结束后常规缝合大鼠硬脑膜、头皮。

（4）对于工业控制网络设备资产的管理与监控能力不足。目前绝大多数的工业控制网络中并没有对于其设备资产的管理与监控机制，容易受到攻击。

1.2.5HE染色和显微镜观察 在造模后1个月处死大鼠，于大鼠皮层损伤区取材，石蜡包埋切片，HE染色，在40倍、200倍、400倍光学显微镜观察。

圆筒段需先进行地基处理再开挖施工，作业面分段提交，考虑到分段提交时作业面较窄，无法投入较多的设备同时施工。计划投入1艘8方抓斗船（配备有6方小斗），1艘抽砂泵船进行施工， 3区施工时视情况调派水上钩机协助方桩拔出施工。

1.2.4改良大鼠神经功能缺损评分(mNSS) 于建模后1、2、4周，采用双盲法对所有大鼠进行神经功能检测。采用国际通用的改良mNSS神经功能缺损评分检测，重复检测3次取其平均值(0～18分)。

2.2神经干细胞的存活及分化情况 造模后1个月HE染色，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组损伤区组织断裂，有空洞形成；与Ⅱ组比较，Ⅲ组、Ⅳ组移植处的空洞较少；与Ⅲ组比较，Ⅳ组移植处的空洞较少。见图1。

2 结果

从定义上来看，地理信息生成系统中的数据反映的是空间地理实体位置、属性和拓扑关系，侧重点在于空间信息和属性信息；地图制图中的数据最终会以地图产品输出，更侧重形象、直观地描述地球表面的自然地理和社会人文等要素。

表1 不同组别大鼠改良mNSS评分

图1 各组小鼠损伤区组织HE染色

3 讨论

人类中枢神经系统存在具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞，而具有再生能力的NSC发挥功能与干细胞微环境和自身的基因表达存在密切联系。SC可合成和释放生物活性因子，诱导神经元生长锥生长、轴突生成。NSC向神经元的分化率很低，且神经元的轴突生长方向不易控制。研究表明在神经损伤后的NSC能够在具有适宜微环境的移植物中生长、分化、增殖[4-5]。因此，移植后的神经干细胞修复受自身基因的表达和微环境的影响。NgR是成人中枢神经系统中限制神经元再生的主要分子，Nogo蛋白通过与NgR结合可导致生长锥塌陷并抑制神经元轴突的延伸[6]。有动物实验发现Nogo蛋白能促进臂丛神经断裂的再生[7]。Hu等[8]研究也显示了Nogo在背根神经节神经元的调节中起重要作用。Solomom等[9]发现了通过抑制NgR信号传导能促进视神经损伤后轴突的重新伸展。最近的研究发现，通过对TBI小鼠进行NgR的调控，可以影响小鼠的记忆、认知和情绪，对于NgR过表达的小鼠出现了海马依赖性损伤，表明了NgR是突触形成的调控因子，能稳定和塑造记忆功能[10]。这些研究均表明了NgR在神经元的再生中有重要作用。NgR基因的敲除，为TBI的治疗提供了一个靶点。通过慢病毒载体转录，产生NgR抗体，阻止NgR对神经元再生的抑制，可促进NSC轴突再生[11]。

NSC能增加神经元的数量，SC能够分泌各种营养因子，为神经元的生长提供合适的环境，而对NgR进行抑制能促进轴突生长，因此，将三者相结合，可能更有助于中枢神经损伤的修复，其效果可能大于单一修复。但是如何将三者完美结合，亦是一个必须面对的课题。有学者将NSC或SC移植于周围神经或脊髓损伤区，但是很多情况下受损区域只是被杂乱无章的胶质瘢痕所取代[12]，其原因可能是损伤后的干细胞缺乏诱导，无法控制轴突生长方向，导致其无法定向生长，几乎对神经修复不产生作用。而组织工程技术应用恰恰能对解决这一问题提供帮助。组织工程的核心是用生物材料构建出细胞和组织的替代品并且促进生物功能的恢复[13]。生物材料提供了一个细胞贴附、增殖、分化的可调控的三维立体微环境[14]。常见的组织工程支架PLGA能给细胞定向生长提供一个框架，阻止其杂乱生长，通过调整支架的形状达到预想的生长方向。已有研究将NSC移植于PLGA中，发现PLGA确实能引导NSC的生长，但是其中存在着各种各样的问题，较为常见的是如何使移植细胞在PLGA上贴壁生长[15]。最新的研究发现了一种天然生物聚合物贴附蛋白(mussel adhesive protein，MAP),由于其独特的粘合作用，赋予细胞粘附，细胞增殖和生物相容的性能，解决了传统的聚合物使细胞贴附困难的问题[16]。

绘制符号首先要从其外观上进行设计，从路灯符号角度来讲，其结构很简单，主要是由一个灯杆和灯泡组成。在设计时，灯杆和灯泡尽可能简单明了。本文给出了一个灯杆和2个球体灯泡的设计样式，如图2所示。

本研究将NgR基因沉默的NSC和SC联合移植于创伤性脑损伤大鼠皮层损伤区，既增加了神经元的数量，又提供了神经元生长的微环境，并促进了轴突生长。而且又有组织工程支架PLGA，为神经干细胞的生长提供了一个定向生长的空间，避免其杂乱生长，为神经的定向修复提供了保驾。而且在体外培养时，我们发现NSC和SC在PLGA支架上联合培养比NSC单一培养在PLGA支架上贴壁、分化，增殖更容易，这又大大解决了细胞在PLGA支架上贴壁生长困难这一问题。有研究[17]将NgR基因沉默后的骨髓间充质干细胞和SC移植于大鼠脊髓损伤区,采用组织工程材料提供支架，同时在体外培养，使其形成一个组织工程化的桥接器件，结果发现NgR基因沉默后的联合移植对脊髓损伤的修复优于NgR基因未沉默的移植。这与本研究将NgR基因沉默神经干细胞和雪旺细胞-PLGA移植于创伤性脑损伤大鼠皮层损伤区促进神经元轴突再生，并有助于运动功能的恢复的研究结果相一致。说明了这种将NgR基因沉默神经干细胞和雪旺细胞联合移植的方法有助于中枢神经的损伤修复，并且用组织工程材料PLGA支架能够极大程度上诱导细胞的定向生长，对神经的修复提供助益。本动物实验结果发现NgR基因沉默，比NgR基因未沉默的神经干细胞和雪旺细胞-PLGA复合体移植对大鼠运动能力的恢复更优，并且组织学结果也有相同的发现。将NgR基因沉默神经干细胞和雪旺细胞-PLGA共移植于创伤性脑损伤大鼠可促进神经修复，可能为人TBI的修复提供了一个可行的研究思路。